Suplementace zinkem u diabetiků 2. typu

Účastníci studie

Čtyřicet diabetiků 2. typu mužského pohlaví, rekrutovaných z ambulantní kliniky v National University Hospital v Singapuru, bude randomizováno do dvou tablet buď 100 mg glukonátu zinečnatého (GNC, USA) nebo placeba (99 % mikrokrystalická celulóza, 1 % stearát hořečnatý). za den po dobu 3 měsíců. Do této studie budou zahrnuti jedinci ve věku 21 let a více, kteří splnili kritéria American Diabetes Association pro diagnózu diabetes mellitus 2. typu. Vyloučíme ty, kteří: konzumovali volně prodejné léky nebo léky na předpis, vitamínové/minerální doplňky nebo tradiční čínské léky, prodělali akutní infekci méně než 30 dní před začátkem studie, bylo jim diagnostikováno aktivní neuropsychiatrické onemocnění nebo hematologické onemocnění, měli hemoglobin méně než 10 g/dl, dříve užívali narkotika nebo pravidelně konzumovali alkohol více než 14 jednotek týdně. Každý účastník poskytne před svou účastí v této studii písemný informovaný souhlas.

Suplementace a odběry krve a moči

Nemocniční výzkumný lékárník bude zaměstnán, aby randomizoval, oslepil přidělené léčebné skupiny a spočítal zbývající tablety, aby se posoudila kompliance. Vzorky krve a moči budou odebrány po 8hodinovém hladovění na začátku (před suplementací), ve dnech 3 a 7, v 1., 2. a 3. měsíci během suplementace a 1 měsíc po příjmu zinku nebo placeba (vymytí). Alikvot krve bude odebrán do obyčejných nebo EDTA zkumavek pro separaci séra nebo plazmy.

Markery oxidačního poškození

Vzorky krve odebrané do EDTA zkumavek budou odstředěny, do plazmy se přidají indomethacin a butylovaný hydroxytoluen a čerstvé vzorky moči se umístí do polypropylenových zkumavek. Připravené vzorky budou až do analýzy skladovány při -80oC. Biomarkery související s oxidačním stresem, F2-IsoP, F4-NP, HETE, COP a alantoin, budou měřeny plynovou chromatografií-hmotnostní spektrometrií za použití metod, které byly popsány dříve. Stručně řečeno, smíšené těžké izotopy, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (dárek od prof. Jasona D. Morrowa (zesnulého), Eiscosanoid Core Laboratory na Vanderbilt University), 5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 a kyselina arachidonová-d8 a kyselina dokosahexaenová-d5 a 7-OH cholesterol-d7, 24- OH cholesterol-d7 a 26 (27)-OH cholesterol-d5 a 7-keto-cholesterol-d7 budou přidány do plazmy pro kvantifikaci markerů oxidačního stresu. Pro měření celkových (volných a esterifikovaných) forem produktů F2-IsoPs, F4-NP a HETEs bude do plazmy přidán 1M hydroxid draselný připravený v methanolu (1:1) a hydrolýza prováděna při 37oC po dobu 30 minut. Poté se postupně přidá a promíchá methanol, 5 M HC1 a 40 mM kyselina mravenčí (pH 4,6). Směs plazmy bude poté purifikována pomocí aniontově výměnné extrakce na pevné fázi (SPE). Pro měření volných forem v plazmě a moči (F2-IsoPs a HETE) se do vzorku plazmy nebo moči přidá 40 mM kyselina mravenčí (pH 4,5), promíchá se a poté se čistí pomocí SPE. Hladiny kreatininu v moči budou měřeny za účelem standardizace F2-IsoP a HETE v moči (Sigma Diagnostic kit, USA).

Vyčištěné vzorky pak budou derivatizovány a analyzovány pomocí plynové chromatografie (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA) spojené s hmotnostně selektivním detektorem (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA) (GC-MS). Pro F2-IsoP, F4-NP, HETE (směs 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- a 20-HETE) a měření celkového arachidonátu a celkového dokosahexanoátu, negativní chemická ionizace (NCI ) bude aplikován režim a chromatografické separace budou prováděny na kapilární koloně z taveného oxidu křemičitého potažené zesítěným 5% fenylmethylsiloxanem (HP-5, Agilent Technologies, USA). Pro stanovení COPs bude použit mód elektronové ionizace a chromatografické separace budou provedeny na kapilární koloně z taveného oxidu křemičitého potažené zesítěným 5% fenylmethylsiloxanem (Ultra 2 J&W, USA). Koncentrace produktů oxidace lipidů budou vypočteny porovnáním plochy píku každé sloučeniny s příslušným deuterovaným vnitřním standardem.

Pro analýzu alantoinu a urátů bude 25 ul plazmy odstředěno pomocí Nanosep filtrů (10 kDa) a k filtrátu bude přidáno 25 ul 4 mM 15N alantoinu a 100 ul acetonitrilu, promícháno a poté vysušeno pod plynným dusíkem. Vysušený vzorek bude poté derivatizován pomocí 50 ml N-(butyl-dimethyl-silyl)-2,2,2-trifluor-N-methylacetamidu (MTBSTFA) v pyridinu (1:1 v/v) při 50 °C po dobu 2 h. Allantoin bude analyzován pomocí GC-MS. Separace budou prováděny na kapilární koloně z taveného oxidu křemičitého potažené zesítěným 5% fenylmethylsiloxanem (Ultra 2, Agilent, USA). Derivatizované vzorky alantoinu (1 µl) budou injikovány do GC-MS. Kvantifikace alantoinu bude vypočítána srovnáním s těžkým izotopem.

Pro analýzu urátů bude 80 ul vody přidáno do 20 ul plazmy, promícháno a poté odstředěno pomocí filtrů Nanosep (10 kDa). Filtrát se poté vstříkne do HPLC (Agilent Technologies, USA) spojené s UV detektorem. Chromatografická separace bude dosažena pomocí 250 mm kolon Zorbax SB-C8 za izokratických podmínek, kdy pro mobilní fázi bude použit 2 mM NH4H2PO4 (pH 2,95). Změří se plocha píku eluované kyseliny močové a určí se koncentrace proti lineární kalibrační křivce sestrojené se vzorky obohacenými čistým urátem.

Klinické parametry sérových a hematologických indexů

Glukóza v krvi, HbA1c a inzulín, sérový hsCRP, cholesterol, LDL, HDL, triglyceridy a železo budou měřeny pomocí analyzátoru Cobas C111 (Roche Diagnostics, Švýcarsko). Hladiny zinku a mědi v séru budou stanoveny v Referral Laboratory v Singapurské všeobecné nemocnici a bílý a červený krevní obraz, hemoglobin, koncentrace hematokritu, krevní destičky, neutrofily a lymfocyty budou hodnoceny pomocí Full Blood Count Analyzer (Sysmex, Japonsko). .

Cévní indexy

Technika analýzy pulzních vln bude použita ke stanovení aortálního tlaku a indexu augmentace (AIx). Záznamy rychlosti pulzní vlny budou provedeny z radiální tepny pomocí Millarova tonometru a data budou shromážděna a analyzována pomocí SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Austrálie), který umožňoval kontinuální záznam tlaku v radiální tepně. průběh. AIx se vypočítá vydělením rozdílu tlaku mezi prvním a druhým systolickým vrcholem tvaru vlny aortálního tlaku vypočítaným tlakem pulsu aorty.

Měření dusičnanů/dusitanů v plazmě bude přizpůsobeno měření Tsikas. Ve stručnosti, do 200 ul plazmatické těžké značky se přidá 15N NO3- a 15N NO2-, přidá se 800 ul acetonu a 100 ul pentafluorbenzylbromidu (PFBBr), promíchá se a inkubuje se při 50 °C po dobu 60 minut. Acetonová část se odpaří pod dusíkem a poté se přidá 500 ul toluenu a intenzivně se míchá po dobu 1 minuty. Organický extrakt se získá odstředěním při 2000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut při 4 °C. Derivatizované vzorky budou analyzovány pomocí GC-MS/NCI. Separace budou prováděny na kapilární koloně z taveného oxidu křemičitého potažené zesítěným 5% fenylmethylsiloxanem. Derivatizované vzorky (1 µl) budou vstřikovány do GC injekčního portu pomocí splitless režimu. Kvantifikace dusičnanů/dusitanů se vypočte porovnáním plochy píku každé sloučeniny s příslušným silně značeným vnitřním standardem 15N NO3- a 15N NO2-.

Statistické analýzy

Statistická analýza bude provedena pomocí GraphPad Prism verze 5.0 pro Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, USA). Všechny hodnoty budou vyjádřeny jako průměr SD. Párový Studentův t-test bude proveden mezi základní linií a každým časovým bodem během suplementace a po vymývací periodě. Jakékoli významné změny zjištěné Studentovým t-testem potvrdí ANOVA opakovaným měřením pro posouzení účinků zinku v průběhu času.