2型糖尿病患者における亜鉛補給

研究参加者

シンガポールの国立大学病院の外来診療所から募集された 40 人の男性 2 型糖尿病患者は、無作為に 100 mg グルコン酸亜鉛 (GNC、米国) またはプラセボ (99% 微結晶セルロース、1% ステアリン酸マグネシウム) の 2 つの錠剤を受け取るように割り当てられます。 3ヶ月間毎日。 ２型糖尿病の診断に関する米国糖尿病協会の基準を満たした２１歳以上の被験者がこの研究に含まれる。 -市販薬または処方薬、ビタミン/ミネラルサプリメント、または伝統的な中国の治療法を消費した人、研究開始前の30日以内に急性感染症にかかった人、アクティブな神経精神疾患または血液学的疾患と診断された人疾患、ヘモグロビンが 10g/dL 未満、以前に麻薬を使用していた、または週に 14 単位を超える定期的なアルコール摂取があった。 各参加者は、この研究に参加する前に書面によるインフォームド コンセントを提供します。

血液と尿の補充とサンプリング

病院の研究薬剤師は、コンプライアンスを評価するために、割り当てられた治療グループを無作為化し、盲検化し、残りの錠剤を数えることに従事します。 血液およびスポット尿サンプルは、ベースラインでの8時間の絶食後（補給前）、3および7日目、補給中の1、2および3か月目、および亜鉛またはプラセボの摂取後（ウォッシュアウト）の1か月後に採取されます。 血液のアリコートは、それぞれ血清または血漿の分離のためにプレーンまたは EDTA チューブに収集されます。

酸化損傷のマーカー

EDTA チューブに採取した血液サンプルを遠心分離し、インドメタシンとブチル化ヒドロキシトルエンを血漿に加え、新鮮な尿サンプルをポリプロピレンチューブに入れます。 準備されたサンプルは、分析まで-80oCで保存されます。 酸化ストレス関連のバイオマーカー、F2-IsoP、F4-NP、HETE、COP、およびアラントインは、前述の方法を使用したガスクロマトグラフィー質量分析によって測定されます。 簡単に言えば、混合重同位体、8-iso-PGF2α-d4、IPF2α-VI-d4、[18O2] F4-NP (ヴァンダービルト大学の Eiscosanoid Core Laboratory の Jason D. Morrow 教授 (故人) からの寄贈)、5(S )-HETE-d8、12(S)-HETE-d8、15(S)-HETE-d8、20-HETE-d6、アラキドン酸-d8、ドコサヘキサエン酸-d5、7-OH コレステロール-d7、24-酸化ストレスマーカーの定量化のために、OHコレステロール-d7および26(27)-OHコレステロール-d5および7-ケト-コレステロール-d7を血漿に添加する。 F2-IsoP、F4-NP、および HETE 生成物の合計 (遊離型およびエステル化型) を測定するには、メタノールで調製した 1 M 水酸化カリウムを血漿 (1:1) に添加し、37oC で 30 分間加水分解を行います。 その後、メタノール、５Ｍ ＨＣｌ、４０ｍＭギ酸（ｐＨ４．６）を順次加えて混合する。 血漿混合物は、陰イオン交換固相抽出 (SPE) を使用して精製されます。 血漿および尿中のフリー フォーム (F2-IsoP および HETE) を測定するには、40 mM ギ酸 (pH 4.5) を血漿または尿サンプルに添加し、混合してから SPE で精製します。 尿中クレアチニンレベルを測定して、尿中F2-IsoPおよびHETEを標準化します(Sigma Diagnostic kit、米国)。

次に、精製されたサンプルを誘導体化し、質量選択検出器（Hewlett-Packard 5973N、Agilent Technologies、USA）に結合されたガスクロマトグラフィー（Hewlett-Packard 6890、Agilent Technologies、USA）（GC-MS）を使用して分析します。 F2-IsoP、F4-NP、HETE (5(S)-、12(S)-、15(S)-、および 20-HETE の混合物)、および総アラキドン酸と総ドコサヘキサノエートの測定、負の化学イオン化 (NCI ）モードが適用され、クロマトグラフィー分離は、架橋された5％フェニルメチルシロキサン（HP-5、Agilent Technologies、USA）でコーティングされたフューズドシリカキャピラリーカラムで実行されます。 COP を決定するために、電子イオン化モードが適用され、架橋 5% フェニルメチルシロキサン (Ultra 2 J&W、米国) でコーティングされたフューズド シリカ キャピラリー カラムでクロマトグラフィー分離が実行されます。 脂質酸化生成物の濃度は、各化合物のピーク面積を関連する重水素化内部標準と比較することによって計算されます。

アラントインおよび尿酸の分析では、25 ul の血漿を Nanosep フィルター (10 kDa) を使用して遠心分離し、濾液に 25 ul の 4 mM 15N アラントインと 100 ul のアセトニトリルを加え、混合し、窒素ガス下で乾燥させます。 次に、乾燥したサンプルを、ピリジン中の 50 ml の N-(ブチル-ジメチル-シリル)-2,2,2-トリフルオロ-N-メチル-アセトアミド (MTBSTFA) (1:1 v/v) で、50℃で 2 分間誘導体化します。 h. アラントインはGC-MSで分析されます。 分離は、架橋された 5% フェニルメチルシロキサン (Ultra 2、Agilent、米国) でコーティングされたフューズド シリカ キャピラリー カラムで実行されます。 誘導体化されたアラントイン サンプル (1 μl) を GC-MS に注入します。 アラントインの定量化は、重同位体との比較によって計算されます。

尿酸分析では、80 ul の水を 20 ul の血漿に加え、混合し、Nanosep フィルター (10 kDa) を使用して遠心分離します。 次いで、濾液をＵＶ検出器に接続されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）に注入する。 クロマトグラフ分離は、移動相に 2 mM NH4H2PO4 (pH 2.95) を使用するアイソクラティック条件下で 250 mm Zorbax SB-C8 カラムを使用して達成されます。 溶出した尿酸ピークの面積を測定し、純粋な尿酸をスパイクしたサンプルで作成した線形検量線に対して濃度を決定します。

血清および血液学的指標の臨床パラメータ

血糖、ＨｂＡ１ｃおよびインスリン、血清ｈｓＣＲＰ、コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリドおよび鉄は、Ｃｏｂａｓ Ｃ１１１分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、スイス）を使用して測定される。 血清亜鉛および銅レベルは、シンガポール総合病院の紹介検査室で測定され、白血球および赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット濃度、血小板、好中球、およびリンパ球は、Full Blood Count Analyzer (Sysmex、日本) を使用して評価されます。 .

血管指数

脈波分析の技術を使用して、大動脈圧および増強指数 (AIx) を決定します。 Millar眼圧計を使用して橈骨動脈から脈波速度を記録し、SphygmoCor（SphygmoCor 2000 v7.0、PWV Medical、シドニー、オーストラリア）を使用してデータを収集および分析します。これにより橈骨動脈圧の連続記録が可能になります。波形。 AIx は、大動脈圧波形の 1 番目と 2 番目の収縮期ピークの間の圧力差を、計算された大動脈脈圧で割ることによって計算されます。

プラズマ硝酸塩/亜硝酸塩の測定は、Tsikas のものから適応されます。 簡単に説明すると、200 μl の血漿重標識 15N NO3- および 15N NO2- を加え、800 μl のアセトンと 100 μl のペンタフルオロベンジル ブロマイド (PFBBr) を加えて混合し、50°C で 60 分間インキュベートします。 アセトン部分を窒素下で蒸発させた後、500 μl のトルエンを加え、1 分間激しく混合します。 有機抽出物は、2000 rpm で 5 分間、4 °C で遠心分離することによって得られます。 誘導体化されたサンプルは、GC-MS/NCI によって分析されます。 分離は、架橋された 5% フェニル メチル シロキサンでコーティングされたフューズド シリカ キャピラリー カラムで実行されます。 誘導体化されたサンプル (1 µl) は、スプリットレス モードを使用して GC インジェクション ポートに注入されます。 硝酸塩/亜硝酸塩の定量化は、各化合物のピーク面積を、関連する重標識内部標準 15N NO3- および 15N NO2- と比較することによって計算されます。

統計分析

Macintosh用のGraphPad Prismバージョン5.0（GraphPad Prism Software、カリフォルニア州、米国）を使用して、統計分析を実行します。 すべての値は平均 SD として表されます。 対応のあるスチューデントの t 検定は、ベースラインと補充中の各時点の間およびウォッシュアウト期間後に実行されます。 スチューデントの t 検定によって検出された有意な変化は、経時的な亜鉛の効果を評価するための反復測定による ANOVA によって確認されます。