Suplementação de zinco em diabéticos tipo 2

Participantes do estudo

Quarenta diabéticos tipo 2 do sexo masculino, recrutados no ambulatório do National University Hospital, em Cingapura, serão randomizados para receber dois comprimidos de 100 mg de gluconato de zinco (GNC, EUA) ou placebo (99% de celulose microcristalina, 1% de estearato de magnésio) por dia durante 3 meses. Indivíduos com 21 anos ou mais que preencheram os critérios da American Diabetes Association para o diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2 serão incluídos neste estudo. Excluiremos aqueles que: consumiram medicamentos de venda livre ou prescritos, suplementos vitamínicos/minerais ou remédios tradicionais chineses, sofreram infecção aguda menos de 30 dias antes do início do estudo, foram diagnosticados com doença neuropsiquiátrica ativa ou doença hematológica doenças, hemoglobina inferior a 10g/dL, uso prévio de entorpecentes ou consumo regular de álcool superior a 14 unidades por semana. Cada participante fornecerá consentimento informado por escrito antes de sua participação neste estudo.

Suplementação e coleta de sangue e urina

Um farmacêutico de pesquisa hospitalar será contratado para randomizar, cegar os grupos de tratamento designados e contar os comprimidos restantes para avaliar a adesão. Amostras de sangue e urina serão coletadas após um jejum de 8 horas no início (antes da suplementação), dias 3 e 7, meses 1, 2 e 3 durante a suplementação e 1 mês após a ingestão de zinco ou placebo (washout). Uma alíquota de sangue será coletada em tubos simples ou EDTA para separação de soro ou plasma, respectivamente.

Marcadores de dano oxidativo

Amostras de sangue coletadas em tubos de EDTA serão centrifugadas, indometacina e hidroxitolueno butilado adicionados ao plasma, e amostras de urina fresca colocadas em tubos de polipropileno. As amostras preparadas serão armazenadas a -80oC até a análise. Biomarcadores relacionados ao estresse oxidativo, F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs, COPs e alantoína, serão medidos por cromatografia gasosa-espectrometria de massa usando métodos descritos anteriormente. Resumidamente, isótopos pesados ​​misturados, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (presente do Prof. Jason D. Morrow (falecido), Eiscosanoid Core Laboratory na Vanderbilt University), 5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 e ácido araquidônico-d8 e ácido docosahexaenóico-d5, e 7-OH colesterol-d7, 24- OH colesterol-d7 e 26(27)-OH colesterol-d5 e 7-ceto-colesterol-d7 serão adicionados ao plasma para quantificação dos marcadores de estresse oxidativo. Para medir as formas totais (livres e esterificadas) dos produtos F2-IsoPs, F4-NPs e HETEs, hidróxido de potássio 1 M preparado em metanol será adicionado ao plasma (1:1) e a hidrólise será realizada a 37oC por 30 minutos. Em seguida, metanol, HCl 5 M e ácido fórmico 40 mM (pH 4,6) serão adicionados sequencialmente e misturados. A mistura de plasma será então purificada usando extração de fase sólida de troca aniônica (SPE). Para medir as formas livres no plasma e na urina (F2-IsoPs e HETEs), será adicionado ácido fórmico 40 mM (pH 4,5) à amostra de plasma ou urina, misturada e então purificada por SPE. Os níveis de creatinina urinária serão medidos para padronizar F2-IsoPs e HETEs urinários (kit Sigma Diagnostic, EUA).

As amostras purificadas serão então derivatizadas e analisadas por cromatografia gasosa (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, EUA) acoplada a um detector seletivo de massa (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, EUA) (GC-MS). Para F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs (uma mistura de 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- e 20-HETEs), e medições de araquidonato total e docosahexanoato total, ionização química negativa (NCI ) e as separações cromatográficas serão realizadas em coluna capilar de sílica fundida revestida com fenilmetilsiloxano 5% reticulado (HP-5, Agilent Technologies, EUA). Para determinar os COPs, o modo de ionização eletrônica será aplicado e as separações cromatográficas serão realizadas em uma coluna capilar de sílica fundida revestida com fenilmetilsiloxano 5% reticulado (Ultra 2 J&W, EUA). As concentrações dos produtos da oxidação lipídica serão calculadas comparando a área do pico de cada composto com o padrão interno deuterado relevante.

Para análise de alantoína e urato, 25 ul de plasma serão centrifugados usando filtros Nanosep (10 kDa) e ao filtrado serão adicionados 25 ul de alantoína 4 mM 15N e 100 ul de acetonitrila, misturados e secos sob nitrogênio gasoso. A amostra seca será então derivatizada com 50 ml de N-(butil-dimetil-silil)-2,2,2-trifluoro-N-metil-acetamida (MTBSTFA) em piridina (1:1 v/v) a 50oC por 2 h. A alantoína será analisada por GC-MS. As separações serão realizadas em coluna capilar de sílica fundida revestida com fenilmetilsiloxano 5% reticulado (Ultra 2, Agilent, EUA). Amostras derivadas de alantoína (1 µl) serão injetadas no GC-MS. A quantificação da alantoína será calculada por comparação com o isótopo pesado.

Para análise de urato, 80 ul de água serão adicionados a 20 ul de plasma, misturados e então centrifugados usando filtros Nanosep (10 kDa). O filtrado será então injetado em um HPLC (Agilent Technologies, EUA) acoplado a um detector de UV. A separação cromatográfica será realizada usando colunas Zorbax SB-C8 de 250 mm sob condição isocrática onde 2 mM NH4H2PO4 (pH 2,95) será usado para a fase móvel. A área do pico de ácido úrico eluído será medida e a concentração determinada contra a curva de calibração linear construída com as amostras enriquecidas com urato puro.

Parâmetros clínicos de índices séricos e hematológicos

Glicemia, HbA1c e insulina, hsCRP sérico, colesterol, LDL, HDL, triglicérides e ferro serão medidos usando o analisador Cobas C111 (Roche Diagnostics, Suíça). Os níveis séricos de zinco e cobre serão determinados no Laboratório de Referência do Hospital Geral de Cingapura, e as contagens de glóbulos brancos e vermelhos, hemoglobina, concentrações de hematócrito, plaquetas, neutrófilos e linfócitos serão avaliadas usando o Full Blood Count Analyzer (Sysmex, Japão) .

índices vasculares

A técnica de análise da onda de pulso será utilizada para determinar a pressão aórtica e o índice de aumento (AIx). Os registros da velocidade da onda de pulso serão feitos a partir da artéria radial usando um tonômetro Millar, e os dados serão coletados e analisados ​​usando o SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Austrália), que permitiu o registro contínuo da pressão da artéria radial forma de onda. O AIx será calculado dividindo a diferença de pressão entre o primeiro e o segundo picos sistólicos da forma de onda da pressão aórtica pela pressão de pulso aórtica calculada.

A medição de nitrato/nitrito plasmático será adaptada da de Tsikas. Resumidamente, a 200 µl de plasma heavy label 15N NO3- e 15N NO2- serão adicionados, 800 µl de acetona e 100 µl de brometo de pentafluorobenzila (PFBBr) serão adicionados, misturados e incubados a 50°C por 60 min. A porção de acetona será evaporada sob nitrogênio e então 500 µl de tolueno serão adicionados e misturados vigorosamente por 1 min. O extrato orgânico será obtido por centrifugação a 2000 rpm por 5 min a 4°C. Amostras derivadas serão analisadas por GC-MS/NCI. As separações serão realizadas em coluna capilar de sílica fundida revestida com fenil metil siloxano reticulado a 5%. As amostras derivadas (1µl) serão injetadas na porta de injeção do GC usando um modo splitless. A quantificação de nitrato/nitrito será calculada comparando a área do pico de cada composto com o padrão interno pesado marcado relevante 15N NO3- e 15N NO2-.

análise estatística

A análise estatística será realizada usando o GraphPad Prism versão 5.0 para Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, EUA). Todos os valores serão expressos como SD médio. O teste t de Student pareado será realizado entre a linha de base e cada ponto de tempo durante a suplementação e após o período de wash-out. Quaisquer alterações significativas detectadas pelo teste t de Student serão confirmadas por ANOVA com medidas repetidas para avaliar os efeitos do zinco ao longo do tempo.