2 型糖尿病患者的锌补充剂

研究参与者

从新加坡国立大学医院门诊部招募的 40 名男性 2 型糖尿病患者将随机接受两片 100 毫克葡萄糖酸锌（GNC，美国）或安慰剂（99% 微晶纤维素，1% 硬脂酸镁）每天 3 个月。 本研究将纳入符合美国糖尿病协会 2 型糖尿病诊断标准的 21 岁及以上受试者。 我们将排除以下人员：服用过非处方药或处方药、维生素/矿物质补充剂或传统中药，在研究开始前不到 30 天遭受急性感染，被诊断患有活动性神经精神疾病或血液病疾病，血红蛋白低于 10g/dL，以前使用过麻醉药或每周定期饮酒超过 14 单位。 在参与本研究之前，每个参与者都将提供书面知情同意书。

血液和尿液的补充和取样

将聘请一名医院研究药剂师对分配的治疗组进行随机化、盲化并计算剩余药片的数量，以评估依从性。 在基线（补充前）禁食 8 小时后、第 3 天和第 7 天、补充期间第 1、2 和 3 个月以及摄入锌或安慰剂后 1 个月（洗脱）后采集血样和尿样。 将等分的血液收集在普通管或 EDTA 管中，分别用于血清或血浆分离。

氧化损伤标志物

收集到 EDTA 管中的血液样本将被离心，将吲哚美辛和丁基羟基甲苯加入血浆中，并将新鲜尿液样本置于聚丙烯管中。 准备好的样品将储存在 -80oC 直至分析。 氧化应激相关的生物标志物 F2-IsoP、F4-NP、HETE、COP 和尿囊素将使用如前所述的方法通过气相色谱-质谱法进行测量。 简而言之，混合重同位素，8-iso-PGF2α-d4，IPF2α-VI-d4，[18O2] F4-NP（来自范德比尔特大学 Eiscosanoid 核心实验室 Jason D. Morrow 教授（已故）的礼物），5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 和花生四烯酸-d8 和二十二碳六烯酸-d5, 和 7-OH 胆固醇-d7, 24- OH cholesterol-d7 和 26 (27)-OH cholesterol-d5 和 7-keto-cholesterol-d7 将被添加到血浆中以量化氧化应激标记物。 为了测量 F2-IsoP、F4-NP 和 HETE 产物的总（游离和酯化）形式，将在甲醇中制备的 1 M 氢氧化钾（1:1）添加到血浆中，并在 37oC 下水解 30 分钟。 此后，依次加入甲醇、5 M HCl 和 40 mM 甲酸 (pH 4.6) 并混合。 然后使用阴离子交换固相萃取 (SPE) 纯化血浆混合物。 为了测量血浆和尿液中的游离形式（F2-IsoP 和 HETE），将 40 mM 甲酸 (pH 4.5) 添加到血浆或尿液样品中，混合，然后通过 SPE 纯化。 将测量尿肌酐水平以标准化尿 F2-IsoP 和 HETE（Sigma 诊断试剂盒，美国）。

然后将纯化的样品衍生化并使用气相色谱法（惠普 6890，安捷伦科技，美国）耦合到质量选择检测器（惠普 5973N，安捷伦科技，美国）（GC-MS）进行分析。 对于 F2-IsoP、F4-NP、HETE（5(S)-、12(S)-、15(S)- 和 20-HETE 的混合物）以及总花生四烯酸和总二十二碳六酸测量、负化学电离 (NCI ) 模式将在涂有交联的 5% 苯基甲基硅氧烷 (HP-5, Agilent Technologies, USA) 的熔融石英毛细管柱上进行色谱分离。 为了确定 COP，将应用电子电离模式，并在涂有交联的 5% 苯基甲基硅氧烷（Ultra 2 J&W，美国）的熔融石英毛细管柱上进行色谱分离。 脂质氧化产物的浓度将通过将每种化合物的峰面积与相关的氘化内标进行比较来计算。

对于尿囊素和尿酸盐分析，将使用 Nanosep 过滤器 (10 kDa) 离心 25 ul 血浆，并向滤液中添加 25 ul 4 mM 15N 尿囊素和 100 ul 乙腈，混合，然后在氮气下干燥。 然后将干燥的样品用 50 ml N-(丁基-二甲基-甲硅烷基)-2,2,2-三氟-N-甲基-乙酰胺 (MTBSTFA) 的吡啶溶液 (1:1 v/v) 在 50oC 下衍生化 2 H。 尿囊素将通过 GC-MS 进行分析。 分离将在涂有交联的 5% 苯基甲基硅氧烷（Ultra 2，安捷伦，美国）的熔融石英毛细管柱上进行。 衍生尿囊素样品 (1 µl) 将被注入 GC-MS。 将通过与重同位素比较来计算尿囊素的定量。

对于尿酸盐分析，将 80 ul 水添加到 20 ul 血浆中，混合，然后使用 Nanosep 过滤器 (10 kDa) 离心。 然后将滤液注入与 UV 检测器耦合的 HPLC（安捷伦科技，美国）。 色谱分离将使用 250 mm Zorbax SB-C8 柱在等度条件下实现，其中 2 mM NH4H2PO4 (pH 2.95) 将用于流动相。 将测量洗脱尿酸峰的面积，并根据用掺有纯尿酸盐的样品构建的线性校准曲线确定浓度。

血清临床参数和血液学指标

使用 Cobas C111 分析仪（Roche Diagnostics，瑞士）测量血糖、HbA1c 和胰岛素、血清 hsCRP、胆固醇、LDL、HDL、甘油三酯和铁。 血清锌和铜水平将在新加坡中央医院的转诊实验室进行测定，白细胞和红细胞计数、血红蛋白、血细胞比容浓度、血小板、中性粒细胞和淋巴细胞将使用全血细胞计数分析仪（Sysmex，日本）进行评估.

血管指数

脉搏波分析技术将用于确定主动脉压力和增强指数 (AIx)。 将使用 Millar 眼压计从桡动脉进行脉搏波速度记录，并将使用 SphygmoCor（SphygmoCor 2000 v7.0，PWV Medical，悉尼，澳大利亚）收集和分析数据，从而连续记录桡动脉压力波形。 AIx 将通过将主动脉压力波形的第一个和第二个收缩期峰值之间的压力差除以计算出的主动脉脉压来计算。

血浆硝酸盐/亚硝酸盐的测量将根据 Tsikas 的测量进行调整。 简而言之，向 200 µl 血浆重标记 15N NO3- 和 15N NO2- 中加入 800 µl 丙酮和 100 µl 五氟苄基溴 (PFBBr)，混合并在 50°C 下孵育 60 分钟。 丙酮部分将在氮气下蒸发，然后加入 500 µl 甲苯并剧烈混合 1 分钟。 通过在 4°C 下以 2000 rpm 离心 5 分钟获得有机提取物。 衍生样品将通过 GC-MS/NCI 进行分析。 分离将在涂有交联的 5% 苯基甲基硅氧烷的熔融石英毛细管柱上进行。 衍生化样品 (1µl) 将使用不分流模式注入 GC 进样口。 硝酸盐/亚硝酸盐的定量将通过将每种化合物的峰面积与相关重标记内标 15N NO3- 和 15N NO2- 进行比较来计算。

统计分析

将使用适用于 Macintosh 的 GraphPad Prism 5.0 版（GraphPad Prism Software，CA，USA）进行统计分析。 所有值都将表示为平均值 SD。 配对学生 t 检验将在基线和补充期间的每个时间点之间以及清洗期之后进行。 学生 t 检验检测到的任何显着变化将通过 ANOVA 重复测量来确认，以评估锌随时间的影响。