Добавки цинка у диабетиков 2 типа

Участники исследования

Сорок мужчин с диабетом 2 типа, набранных из амбулаторной клиники при Национальном университетском госпитале Сингапура, будут рандомизированы для получения двух таблеток либо 100 мг глюконата цинка (GNC, США), либо плацебо (99% микроцисталиновой целлюлозы, 1% стеарата магния). в день в течение 3 месяцев. В это исследование будут включены субъекты в возрасте 21 года и старше, которые соответствуют критериям Американской диабетической ассоциации для диагностики сахарного диабета 2 типа. Мы исключаем тех, кто: принимал безрецептурные или отпускаемые по рецепту лекарства, витаминно-минеральные добавки или традиционные китайские средства, перенес острую инфекцию менее чем за 30 дней до начала исследования, был диагностирован с активным психоневрологическим заболеванием или гематологическим заболеванием. заболевания, гемоглобин менее 10 г/дл, ранее употреблявшие наркотические средства или регулярно употреблявшие алкоголь более 14 единиц в неделю. Каждый участник предоставит письменное информированное согласие до своего участия в этом исследовании.

Дополнение и забор крови и мочи

Фармацевт-исследователь больницы будет привлечен для рандомизации, ослепления назначенных групп лечения и подсчета оставшихся таблеток, чтобы оценить соблюдение режима лечения. Образцы крови и мочи будут взяты после 8-часового голодания на исходном уровне (до приема добавок), дней 3 и 7, месяцев 1, 2 и 3 во время приема добавок и 1 месяца после приема цинка или плацебо (вымывание). Аликвоту крови собирают в обычные пробирки или пробирки с ЭДТА для разделения сыворотки или плазмы соответственно.

Маркеры окислительного повреждения

Образцы крови, собранные в пробирки с ЭДТА, центрифугируют, в плазму добавляют индометацин и бутилированный гидрокситолуол, а свежие образцы мочи помещают в полипропиленовые пробирки. Подготовленные образцы будут храниться при -80°C до проведения анализа. Биомаркеры, связанные с окислительным стрессом, F2-IsoP, F4-NP, HETE, COP и аллантоин, будут измеряться с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии с использованием методов, описанных ранее. Вкратце, смешанные тяжелые изотопы, 8-изо-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (подарок профессора Джейсона Д. Морроу (покойного), основная лаборатория эйскозаноидов в Университете Вандербильта), 5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 и арахидоновая кислота-d8 и докозагексаеновая кислота-d5 и 7-ОН холестерин-d7, 24- OH-холестерин-d7 и 26 (27)-OH-холестерин-d5 и 7-кето-холестерин-d7 будут добавлены в плазму для количественного определения маркеров окислительного стресса. Для измерения общих (свободных и этерифицированных) форм F2-IsoP, F4-NP и продуктов HETE к плазме будет добавлен 1 М раствор гидроксида калия, приготовленный в метаноле (1:1), и проведен гидролиз при 37°C в течение 30 минут. После этого последовательно добавляют метанол, 5 М HCl и 40 мМ муравьиную кислоту (pH 4,6) и перемешивают. Затем смесь плазмы очищают с помощью анионообменной твердофазной экстракции (ТФЭ). Для измерения свободных форм в плазме и моче (F2-IsoP и HETE) к образцу плазмы или мочи добавляют 40 мМ муравьиной кислоты (pH 4,5), перемешивают и затем очищают с помощью ТФЭ. Уровни креатинина в моче будут измеряться для стандартизации F2-IsoP и HETE в моче (диагностический набор Sigma, США).

Затем очищенные образцы будут дериватизированы и проанализированы с использованием газовой хроматографии (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, США) в сочетании с масс-селективным детектором (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, США) (ГХ-МС). Для F2-IsoP, F4-NP, HETE (смесь 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- и 20-HETE), а также измерений общего арахидоната и общего докозагексаноата отрицательная химическая ионизация (NCI ) и хроматографическое разделение будет проводиться на капиллярной колонке из плавленого кварца, покрытой сшитым 5% фенилметилсилоксаном (HP-5, Agilent Technologies, США). Для определения КПД будет применяться режим электронной ионизации и хроматографическое разделение на капиллярной колонке из плавленого кварца, покрытой сшитым 5% фенилметилсилоксаном (Ultra 2 J&W, США). Концентрации продуктов окисления липидов рассчитывают путем сравнения площади пика каждого соединения с соответствующим дейтерированным внутренним стандартом.

Для анализа аллантоина и уратов 25 мкл плазмы центрифугируют с использованием фильтров Nanosep (10 кДа) и к фильтрату добавляют 25 мкл 4 мМ 15N аллантоина и 100 мкл ацетонитрила, смешивают и затем сушат в атмосфере азота. Затем высушенный образец дериватизируют 50 мл N-(бутилдиметилсилил)-2,2,2-трифтор-N-метилацетамида (МТБСТФА) в пиридине (1:1 по объему) при 50°C в течение 2 часов. час Аллантоин будет проанализирован с помощью ГХ-МС. Разделение будет проводиться на капиллярной колонке из плавленого кварца, покрытой сшитым 5% фенилметилсилоксаном (Ultra 2, Agilent, США). Образцы производного аллантоина (1 мкл) будут вводиться в ГХ-МС. Количественное определение аллантоина будет рассчитываться путем сравнения с тяжелым изотопом.

Для анализа уратов к 20 мкл плазмы добавляют 80 мкл воды, перемешивают и затем центрифугируют с использованием фильтров Nanosep (10 кДа). Затем фильтрат вводят в ВЭЖХ (Agilent Technologies, США), соединенную с УФ-детектором. Хроматографическое разделение будет достигаться с использованием колонок Zorbax SB-C8 диаметром 250 мм в изократических условиях, где в качестве подвижной фазы будет использоваться 2 мМ NH4H2PO4 (pH 2,95). Будет измерена площадь элюированного пика мочевой кислоты, а концентрация определена по линейной калибровочной кривой, построенной для образцов с добавлением чистого урата.

Клинические параметры сыворотки и гематологические показатели

Глюкоза крови, HbA1c и инсулин, hsCRP сыворотки, холестерин, ЛПНП, ЛПВП, триглицериды и железо будут измеряться с помощью анализатора Cobas C111 (Roche Diagnostics, Швейцария). Уровни цинка и меди в сыворотке будут определяться в специализированной лаборатории Сингапурской больницы общего профиля, а белые и красные кровяные тельца, гемоглобин, концентрации гематокрита, тромбоциты, нейтрофилы и лимфоциты будут оцениваться с помощью анализатора полного анализа крови (Sysmex, Япония). .

Сосудистые индексы

Метод анализа пульсовой волны будет использоваться для определения аортального давления и индекса аугментации (AIx). Запись скорости пульсовой волны будет производиться в лучевой артерии с помощью тонометра Миллара, а данные будут собираться и анализироваться с помощью SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Сидней, Австралия), что позволило непрерывно регистрировать давление в лучевой артерии. форма волны. AIx будет рассчитываться путем деления разности давлений между первым и вторым систолическими пиками кривой давления в аорте на расчетное пульсовое давление в аорте.

Измерение нитратов/нитритов в плазме будет адаптировано из измерения Цикаса. Вкратце, к 200 мкл тяжелой метки плазмы добавляют 15N NO3- и 15N NO2-, добавляют 800 мкл ацетона и 100 мкл пентафторбензилбромида (PFBBr), перемешивают и инкубируют при 50°C в течение 60 мин. Часть ацетона выпаривают в атмосфере азота, затем добавляют 500 мкл толуола и энергично перемешивают в течение 1 мин. Органический экстракт получают центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Производные образцы будут проанализированы с помощью GC-MS/NCI. Разделение проводят на капиллярной колонке из плавленого кварца, покрытой сшитым 5% фенилметилсилоксаном. Производные образцы (1 мкл) будут вводиться в порт ввода ГХ в режиме без разделения. Количественное определение нитрата/нитрита будет рассчитываться путем сравнения площади пика каждого соединения с соответствующим внутренним стандартом с тяжелой меткой 15N NO3- и 15N NO2-.

Статистический анализ

Статистический анализ будет выполняться с помощью программы GraphPad Prism версии 5.0 для Macintosh (GraphPad Prism Software, Калифорния, США). Все значения будут выражены как среднее SD. Парный t-критерий Стьюдента будет выполняться между исходным уровнем и каждой временной точкой во время приема добавок и после периода вымывания. Любые существенные изменения, обнаруженные с помощью t-критерия Стьюдента, будут подтверждены ANOVA с повторными измерениями для оценки влияния цинка с течением времени.