Sinkkilisä tyypin 2 diabeetikoille

Tutkimuksen osallistujat

Neljäkymmentä miespuolista tyypin 2 diabeetikkoa, jotka on rekrytoitu Singaporen kansallisen yliopistosairaalan poliklinikalta, satunnaistetaan saamaan kaksi tablettia joko 100 mg sinkkiglukonaattia (GNC, USA) tai lumelääkettä (99 % mikrokystalista selluloosaa, 1 % magnesiumstearaattia) päivässä 3 kuukauden ajan. Tähän tutkimukseen otetaan mukaan 21-vuotiaat ja sitä vanhemmat koehenkilöt, jotka täyttivät American Diabetes Associationin kriteerit tyypin 2 diabeteksen diagnosoimiseksi. Suljemme pois ne, jotka: olivat käyttäneet käsikauppa- tai reseptilääkkeitä, vitamiini-/kivennäislisäaineita tai perinteisiä kiinalaisia ​​lääkkeitä, kärsineet akuutista infektiosta alle 30 päivää ennen tutkimuksen alkamista, joilla on diagnosoitu aktiivinen neuropsykiatrinen sairaus tai hematologinen sairaus. sairauksia, joiden hemoglobiini oli alle 10 g/dl, oli aiemmin käyttänyt huumeita tai nauttinut säännöllisesti alkoholia yli 14 yksikköä viikossa. Jokainen osallistuja antaa kirjallisen tietoisen suostumuksen ennen osallistumistaan ​​tähän tutkimukseen.

Veren ja virtsan täydentäminen ja näytteenotto

Sairaalan tutkimusapteekki satunnaistetaan, sokennetaan määrätyt hoitoryhmät ja lasketaan jäljellä olevat tabletit noudattamisen arvioimiseksi. Veri- ja pistevirtsanäytteet otetaan 8 tunnin paaston jälkeen lähtötilanteessa (ennen lisäravintoa), päivinä 3 ja 7, kuukausina 1, 2 ja 3 lisäravinteen aikana ja 1 kuukausi sinkin tai lumelääkkeen saannin jälkeen (washout). Alikvootti verta kerätään tavallisiin tai EDTA-putkiin seerumin tai plasman erottamista varten.

Oksidatiivisten vaurioiden merkkiaineet

EDTA-putkiin kerätyt verinäytteet sentrifugoidaan, plasmaan lisätään indometasiinia ja butyloitua hydroksitolueenia ja tuoreet virtsanäytteet laitetaan polypropeeniputkiin. Valmistetut näytteet säilytetään -80 oC:ssa analyysiin asti. Oksidatiiviseen stressiin liittyvät biomarkkerit, F2-IsoP:t, F4-NP:t, HETE:t, COP:t ja allantoiini, mitataan kaasukromatografia-massaspektrometrialla käyttämällä aiemmin kuvattuja menetelmiä. Lyhyesti, sekoitettu raskaita isotooppeja, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (lahja prof. Jason D. Morrow'lta (kuollut), Eiscosanoid Core Laboratory at Vanderbilt University), 5(S) )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 ja arakidonihappo-d8 ja dokosaheksaeenihappo-d5 ja 7-OH-kolesteroli-d7, 24- OH-kolesteroli-d7 ja 26 (27)-OH-kolesteroli-d5 ja 7-keto-kolesteroli-d7 lisätään plasmaan oksidatiivisten stressimerkkien kvantifiointia varten. F2-IsoP-, F4-NP- ja HETEs-tuotteiden kokonaismuotojen (vapaiden ja esteröityjen) mittaamiseksi plasmaan lisätään metanolissa valmistettua 1 M kaliumhydroksidia (1:1) ja suoritetaan hydrolyysi 37 oC:ssa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen metanolia, 5 M HCl:a ja 40 mM muurahaishappoa (pH 4,6) lisätään peräkkäin ja sekoitetaan. Plasmaseos puhdistetaan sitten käyttämällä anioninvaihtokiintofaasiuuttoa (SPE). Plasman ja virtsan vapaiden muotojen (F2-IsoPs ja HETE:t) mittaamiseksi plasma- tai virtsanäytteeseen lisätään 40 mM muurahaishappoa (pH 4,5), sekoitetaan ja puhdistetaan sitten SPE:llä. Virtsan kreatiniinitasot mitataan virtsan F2-IsoP:n ja HETE:n standardoimiseksi (Sigma Diagnostic Kit, USA).

Puhdistetut näytteet derivatisoidaan ja analysoidaan käyttämällä kaasukromatografiaa (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA) kytkettynä massaselektiiviseen detektoriin (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA) (GC-MS). F2-IsoP-, F4-NP-, HETE- (5(S)-, 12(S)-, 15(S)- ja 20-HETE-seos) ja kokonaisarakidonaatti- ja dokosaheksanoaatin kokonaismittauksille negatiivinen kemiallinen ionisaatio (NCI) ) -moodia sovelletaan ja kromatografiset erotukset suoritetaan sulatetulla piidioksidikapillaarikolonnilla, joka on päällystetty silloitetulla 5-prosenttisella fenyylimetyylisiloksaanilla (HP-5, Agilent Technologies, USA). COP:iden määrittämiseksi käytetään elektroni-ionisaatiomenetelmää ja kromatografiset erotukset suoritetaan sulatetulla piidioksidikapillaarikolonnilla, joka on päällystetty silloitetulla 5-prosenttisella fenyylimetyylisiloksaanilla (Ultra 2 J&W, USA). Lipidihapetustuotteiden pitoisuudet lasketaan vertaamalla kunkin yhdisteen piikin pinta-alaa asiaankuuluvaan deuteroituun sisäiseen standardiin.

Allantoiini- ja uraattianalyysiä varten 25 ul plasmaa sentrifugoidaan Nanosep-suodattimilla (10 kDa) ja suodokseen lisätään 25 ul 4 mM 15 N allantoiinia ja 100 ul asetonitriiliä, sekoitetaan ja kuivataan sitten typpikaasun alla. Kuivattu näyte derivatisoidaan sitten 50 ml:lla N-(butyylidimetyylisilyyli)-2,2,2-trifluori-N-metyyliasetamidia (MTBSTFA) pyridiinissä (1:1 tilavuus/tilavuus) 50 °C:ssa 2 h. Allantoiini analysoidaan GC-MS:llä. Erotus suoritetaan fuusioidulla piidioksidikapillaarikolonnilla, joka on päällystetty silloitetulla 5-prosenttisella fenyylimetyylisiloksaanilla (Ultra 2, Agilent, USA). Derivatisoidut allantoiininäytteet (1 µl) ruiskutetaan GC-MS:ään. Allantoiinin kvantifiointi lasketaan vertaamalla sitä raskaaseen isotooppiin.

Uraattianalyysiä varten 80 ul vettä lisätään 20 ul:aan plasmaa, sekoitetaan ja sentrifugoidaan sitten käyttämällä Nanosep-suodattimia (10 kDa). Suodos ruiskutetaan sitten HPLC:hen (Agilent Technologies, USA), joka on kytketty UV-detektoriin. Kromatografinen erotus saavutetaan käyttämällä 250 mm Zorbax SB-C8 -pylväitä isokraattisissa olosuhteissa, joissa liikkuvana faasina käytetään 2 mM NH4H2PO4:a (pH 2,95). Eluoituneen virtsahappopiikin pinta-ala mitataan ja pitoisuus määritetään lineaarista kalibrointikäyrää vasten, joka on muodostettu puhtaalla uraatilla lisätyistä näytteistä.

Seerumin kliiniset parametrit ja hematologiset indeksit

Veren glukoosi, HbA1c ja insuliini, seerumin hsCRP, kolesteroli, LDL, HDL, triglyseridi ja rauta mitataan Cobas C111 -analysaattorilla (Roche Diagnostics, Sveitsi). Seerumin sinkki- ja kuparipitoisuudet määritetään Singaporen yleissairaalan lähetelaboratoriossa, ja valko- ja punaveriarvot, hemoglobiini, hematokriittipitoisuudet, verihiutaleet, neutrofiilit ja lymfosyytit mitataan Full Blood Count Analyzer -laitteella (Sysmex, Japani). .

Verisuonten indeksit

Pulssiaaltoanalyysitekniikkaa käytetään aortan paineen ja augmentaatioindeksin (AIx) määrittämiseen. Pulssiaallon nopeustallenteet tehdään säteittäisestä valtimosta Millar-tonometrillä, ja tiedot kerätään ja analysoidaan SphygmoCorilla (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australia), joka mahdollisti jatkuvan säteittäisen valtimon paineen tallentamisen. aaltomuoto. AIx lasketaan jakamalla aortanpaineaaltomuodon ensimmäisen ja toisen systolisen piikin välinen paine-ero lasketulla aortan pulssipaineella.

Plasman nitraatti/nitriitin mittaus mukautetaan Tsikasin mittauksesta. Lyhyesti sanottuna 200 µl:aan plasman raskasta leimaa 15N NO3- ja 15N NO2- lisätään 800 µl asetonia ja 100 µl pentafluoribentsyylibromidia (PFBBr), sekoitetaan ja inkuboidaan 50 °C:ssa 60 minuuttia. Asetoniosa haihdutetaan typen alla ja sitten lisätään 500 ui tolueenia ja sekoitetaan voimakkaasti 1 minuutin ajan. Orgaaninen uute saadaan sentrifugoimalla nopeudella 2000 rpm 5 minuuttia 4 °C:ssa. Johdannaiset näytteet analysoidaan GC-MS/NCI:llä. Erotus suoritetaan sulatetulla piidioksidikapillaarikolonnilla, joka on päällystetty silloitetulla 5-prosenttisella fenyylimetyylisiloksaanilla. Derivatisoidut näytteet (1 µl) injektoidaan GC-injektioporttiin käyttämällä splitless-tilaa. Nitraatin/nitriitin kvantifiointi lasketaan vertaamalla kunkin yhdisteen piikin pinta-alaa asiaankuuluvaan raskaasti merkittyyn sisäiseen standardiin 15N NO3- ja 15N NO2-.

Tilastolliset analyysit

Tilastollinen analyysi suoritetaan GraphPad Prism -versiolla 5.0 Macintoshille (GraphPad Prism Software, CA, USA). Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona SD. Parillinen Studentin t-testi suoritetaan lähtötilanteen ja jokaisen ajankohdan välillä täydennyksen aikana ja poistumisjakson jälkeen. Kaikki Studentin t-testillä havaitut merkittävät muutokset vahvistetaan ANOVA:lla toistuvilla toimenpiteillä sinkin vaikutusten arvioimiseksi ajan kuluessa.