Integrazione di zinco nei diabetici di tipo 2

Partecipanti allo studio

Quaranta diabetici maschi di tipo 2, reclutati dalla clinica ambulatoriale presso il National University Hospital, Singapore, saranno randomizzati a ricevere due compresse da 100 mg di gluconato di zinco (GNC, USA) o placebo (99% cellulosa microcristallina, 1% magnesio stearato) al giorno per 3 mesi. Saranno inclusi in questo studio i soggetti di età pari o superiore a 21 anni che hanno soddisfatto i criteri dell'American Diabetes Association per la diagnosi di diabete mellito di tipo 2. Escluderemo coloro che: avevano consumato farmaci da banco o da prescrizione, integratori vitaminici/minerali o rimedi tradizionali cinesi, avevano sofferto di infezione acuta meno di 30 giorni prima dell'inizio dello studio, erano stati diagnosticati con malattia neuropsichiatrica attiva o malattia ematologica malattie, aveva un'emoglobina inferiore a 10 g/dL, aveva precedentemente fatto uso di stupefacenti o aveva assunto regolarmente alcol in eccesso di 14 unità a settimana. Ogni partecipante fornirà il consenso informato scritto prima della loro partecipazione a questo studio.

Integrazione e prelievo di sangue e urine

Un farmacista di ricerca ospedaliero sarà impegnato a randomizzare, accecare i gruppi di trattamento assegnati e contare le compresse rimanenti in modo da valutare la conformità. Verranno prelevati campioni di sangue e urine spot dopo un digiuno di 8 ore al basale (prima dell'integrazione), giorni 3 e 7, mesi 1, 2 e 3 durante l'integrazione e 1 mese dopo l'assunzione di zinco o placebo (washout). Un'aliquota di sangue sarà raccolta in tubi normali o EDTA rispettivamente per la separazione del siero o del plasma.

Indicatori di danno ossidativo

I campioni di sangue raccolti in provette con EDTA saranno centrifugati, l'indometacina e l'idrossitoluene butilato saranno aggiunti al plasma e i campioni di urina fresca saranno posti in provette di polipropilene. I campioni preparati saranno conservati a -80oC fino al momento dell'analisi. I biomarcatori correlati allo stress ossidativo, F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs, COPs e allantoina, saranno misurati mediante gascromatografia-spettrometria di massa utilizzando i metodi precedentemente descritti. In breve, isotopi pesanti misti, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (dono del Prof. Jason D. Morrow (deceduto), Eiscosanoid Core Laboratory presso la Vanderbilt University), 5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 e acido arachidonico-d8 e acido docosaesaenoico-d5 e 7-OH colesterolo-d7, 24- OH colesterolo-d7 e 26 (27)-OH colesterolo-d5 e 7-cheto-colesterolo-d7 saranno aggiunti al plasma per la quantificazione dei marcatori di stress ossidativo. Per misurare le forme totali (libere ed esterificate) dei prodotti F2-IsoPs, F4-NPs e HETEs, idrossido di potassio 1 M preparato in metanolo sarà aggiunto al plasma (1:1) e l'idrolisi sarà effettuata a 37oC per 30 minuti. Successivamente, metanolo, 5 M HCl e 40 mM di acido formico (pH 4.6) saranno aggiunti e miscelati in sequenza. La miscela di plasma verrà quindi purificata utilizzando l'estrazione in fase solida a scambio anionico (SPE). Per misurare le forme libere nel plasma e nelle urine (F2-IsoPs e HETEs), al campione di plasma o urina verrà aggiunto 40 mM di acido formico (pH 4.5), miscelato e quindi purificato mediante SPE. I livelli di creatinina urinaria saranno misurati per standardizzare F2-IsoPs urinari e HETEs (Sigma Diagnostic kit, USA).

I campioni purificati saranno quindi derivatizzati e analizzati mediante gascromatografia (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA) accoppiata a un rivelatore selettivo di massa (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA) (GC-MS). Per F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs (una miscela di 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- e 20-HETEs) e misure di arachidonato totale e docosaesanoato totale, ionizzazione chimica negativa (NCI ) e le separazioni cromatografiche saranno effettuate su una colonna capillare di silice fusa rivestita con fenilmetilsilossano reticolato al 5% (HP-5, Agilent Technologies, USA). Per determinare i COP, verrà applicata la modalità di ionizzazione elettronica e saranno effettuate separazioni cromatografiche su una colonna capillare di silice fusa rivestita con fenilmetilsilossano reticolato al 5% (Ultra 2 J&W, USA). Le concentrazioni dei prodotti di ossidazione dei lipidi saranno calcolate confrontando l'area del picco di ciascun composto con il relativo standard interno deuterato.

Per l'analisi di allantoina e urato, 25 ul di plasma saranno centrifugati utilizzando filtri Nanosep (10 kDa) e al filtrato verranno aggiunti 25 ul di allantoina 4 mM 15N e 100 ul di acetonitrile, miscelati e quindi essiccati sotto azoto gassoso. Il campione essiccato sarà quindi derivatizzato con 50 ml di N-(butil-dimetil-silil)-2,2,2-trifluoro-N-metil-acetammide (MTBSTFA) in piridina (1:1 v/v) a 50°C per 2 H. L'allantoina sarà analizzata mediante GC-MS. Le separazioni saranno effettuate su una colonna capillare di silice fusa rivestita con fenilmetilsilossano reticolato al 5% (Ultra 2, Agilent, USA). Campioni di allantoina derivatizzata (1 µl) saranno iniettati nel GC-MS. La quantificazione dell'allantoina sarà calcolata per confronto con l'isotopo pesante.

Per l'analisi degli urati, 80 ul di acqua saranno aggiunti a 20 ul di plasma, miscelati e quindi centrifugati utilizzando filtri Nanosep (10 kDa). Il filtrato verrà quindi iniettato in un HPLC (Agilent Technologies, USA) accoppiato a un rivelatore UV. La separazione cromatografica sarà ottenuta usando colonne Zorbax SB-C8 da 250 mm in condizioni isocratiche dove 2 mM NH4H2PO4 (pH 2.95) saranno usati per la fase mobile. L'area del picco dell'acido urico eluito sarà misurata e la concentrazione determinata rispetto alla curva di calibrazione lineare costruita con i campioni arricchiti con urato puro.

Parametri clinici degli indici sierici ed ematologici

Glicemia, HbA1c e insulina, hsCRP sierica, colesterolo, LDL, HDL, trigliceridi e ferro saranno misurati utilizzando l'analizzatore Cobas C111 (Roche Diagnostics, Svizzera). I livelli sierici di zinco e rame saranno determinati presso il laboratorio di riferimento presso il Singapore General Hospital e la conta dei globuli bianchi e rossi, l'emoglobina, le concentrazioni di ematocrito, le piastrine, i neutrofili e i linfociti saranno valutati utilizzando l'analizzatore di emocromo (Sysmex, Giappone) .

Indici vascolari

La tecnica dell'analisi dell'onda del polso verrà utilizzata per determinare la pressione aortica e l'indice di aumento (AIx). Le registrazioni della velocità dell'onda del polso saranno effettuate dall'arteria radiale utilizzando un tonometro Millar e i dati saranno raccolti e analizzati utilizzando lo SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australia), che ha consentito la registrazione continua della pressione dell'arteria radiale forma d'onda. L'AIx sarà calcolato dividendo la differenza di pressione tra il primo e il secondo picco sistolico della forma d'onda della pressione aortica per la pressione del polso aortico calcolata.

La misurazione del nitrato/nitrito plasmatico sarà adattata da quella di Tsikas. In breve, a 200 µl di plasma heavy label 15N NO3- e 15N NO2- verranno aggiunti, 800 µl di acetone e 100 µl di pentafluorobenzil bromuro (PFBBr), miscelati e incubati a 50°C per 60 min. La porzione di acetone verrà evaporata sotto azoto e quindi verranno aggiunti 500 µl di toluene e miscelati vigorosamente per 1 min. L'estratto organico sarà ottenuto mediante centrifugazione a 2000 rpm per 5 min a 4°C. I campioni derivatizzati saranno analizzati mediante GC-MS/NCI. Le separazioni saranno effettuate su una colonna capillare di silice fusa rivestita con fenil metil silossano reticolato al 5%. I campioni derivatizzati (1µl) verranno iniettati nella porta di iniezione del GC utilizzando una modalità splitless. La quantificazione del nitrato/nitrito sarà calcolata confrontando l'area del picco di ciascun composto con il relativo standard interno marcato pesante 15N NO3- e 15N NO2-.

analisi statistiche

L'analisi statistica sarà eseguita utilizzando GraphPad Prism versione 5.0 per Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, USA). Tutti i valori saranno espressi come SD media. Il t-test di Student accoppiato verrà eseguito tra il basale e ogni punto temporale durante l'integrazione e dopo il periodo di wash-out. Eventuali cambiamenti significativi rilevati dal test t di Student saranno confermati da ANOVA con misure ripetute per valutare gli effetti dello zinco nel tempo.