Supplémentation en zinc chez les diabétiques de type 2

Participants à l'étude

Quarante hommes diabétiques de type 2, recrutés à la clinique externe du National University Hospital de Singapour, seront randomisés pour recevoir deux comprimés de 100 mg de gluconate de zinc (GNC, USA) ou un placebo (99 % de cellulose microcystalline, 1 % de stéarate de magnésium) par jour pendant 3 mois. Les sujets âgés de 21 ans et plus qui remplissaient les critères de l'American Diabetes Association pour le diagnostic du diabète sucré de type 2 seront inclus dans cette étude. Nous exclurons ceux qui : avaient consommé des médicaments en vente libre ou sur ordonnance, des suppléments de vitamines/minéraux ou des remèdes traditionnels chinois, avaient souffert d'une infection aiguë moins de 30 jours avant le début de l'étude, avaient reçu un diagnostic de maladie neuropsychiatrique active ou hématologique maladies, avait un taux d'hémoglobine inférieur à 10 g/dL, avait déjà utilisé des stupéfiants ou consommé régulièrement de l'alcool au-delà de 14 unités par semaine. Chaque participant fournira un consentement éclairé écrit avant sa participation à cette étude.

Supplémentation et prélèvement de sang et d'urine

Un pharmacien de recherche hospitalier sera engagé pour randomiser, aveugler les groupes de traitement assignés et compter les comprimés restants afin d'évaluer l'observance. Des échantillons de sang et d'urine ponctuelle seront prélevés après un jeûne de 8 heures au départ (avant la supplémentation), les jours 3 et 7, les mois 1, 2 et 3 pendant la supplémentation et 1 mois après la prise de zinc ou de placebo (lavage). Une aliquote de sang sera prélevée dans des tubes simples ou EDTA pour la séparation du sérum ou du plasma respectivement.

Marqueurs de dommages oxydatifs

Les échantillons de sang prélevés dans des tubes EDTA seront centrifugés, de l'indométhacine et de l'hydroxytoluène butylé seront ajoutés au plasma, et des échantillons d'urine frais placés dans des tubes en polypropylène. Les échantillons préparés seront stockés à -80oC jusqu'à l'analyse. Les biomarqueurs liés au stress oxydatif, F2-IsoPs, F4-NPs, HETEs, COPs et allantoïne, seront mesurés par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse en utilisant les méthodes décrites précédemment. En bref, isotopes lourds mixtes, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (don du professeur Jason D. Morrow (décédé), Eiscosanoid Core Laboratory de l'Université Vanderbilt), 5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 et acide arachidonique-d8 et acide docosahexaénoïque-d5, et 7-OH cholestérol-d7, 24- OH cholestérol-d7 et 26 (27)-OH cholestérol-d5 et 7-céto-cholestérol-d7 seront ajoutés au plasma pour la quantification des marqueurs de stress oxydatif. Pour mesurer les formes totales (libres et estérifiées) des produits F2-IsoPs, F4-NPs et HETEs, de l'hydroxyde de potassium 1 M préparé dans du méthanol sera ajouté au plasma (1:1) et une hydrolyse effectuée à 37oC pendant 30 minutes. Ensuite, du méthanol, du HCl 5 M et de l'acide formique 40 mM (pH 4,6) seront ajoutés et mélangés séquentiellement. Le mélange de plasma sera ensuite purifié par extraction en phase solide par échange anionique (SPE). Pour mesurer les formes libres dans le plasma et l'urine (F2-IsoPs et HETEs), 40 mM d'acide formique (pH 4,5) seront ajoutés à l'échantillon de plasma ou d'urine, mélangés puis purifiés par SPE. Les taux de créatinine urinaire seront mesurés pour standardiser les F2-IsoP et les HETE urinaires (Sigma Diagnostic kit, USA).

Les échantillons purifiés seront ensuite dérivatisés et analysés par chromatographie en phase gazeuse (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA) couplée à un détecteur sélectif de masse (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA) (GC-MS). Pour les F2-IsoPs, les F4-NPs, les HETEs (un mélange de 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- et 20-HETEs), et les mesures de l'arachidonate total et du docosahexanoate total, l'ionisation chimique négative (NCI ) sera appliqué et les séparations chromatographiques seront réalisées sur une colonne capillaire de silice fondue recouverte de phénylméthylsiloxane réticulé à 5% (HP-5, Agilent Technologies, USA). Pour déterminer les COP, le mode d'ionisation électronique sera appliqué et des séparations chromatographiques effectuées sur une colonne capillaire de silice fondue recouverte de phénylméthylsiloxane réticulé à 5 % (Ultra 2 J&W, USA). Les concentrations des produits d'oxydation des lipides seront calculées en comparant la surface du pic de chaque composé avec l'étalon interne deutéré pertinent.

Pour l'analyse de l'allantoïne et de l'urate, 25 ul de plasma seront centrifugés à l'aide de filtres Nanosep (10 kDa) et au filtrat, 25 ul d'allantoïne 15N 4 mM et 100 ul d'acétonitrile seront ajoutés, mélangés puis séchés sous azote gazeux. L'échantillon séché sera ensuite dérivatisé avec 50 ml de N-(butyl-diméthyl-silyl)-2,2,2-trifluoro-N-méthyl-acétamide (MTBSTFA) dans de la pyridine (1:1 v/v) à 50oC pendant 2 h. L'allantoïne sera analysée par GC-MS. Les séparations seront réalisées sur une colonne capillaire en silice fondue recouverte de phénylméthylsiloxane réticulé à 5% (Ultra 2, Agilent, USA). Des échantillons d'allantoïne dérivée (1 µl) seront injectés dans le GC-MS. La quantification de l'allantoïne sera calculée par comparaison avec l'isotope lourd.

Pour l'analyse d'urate, 80 ul d'eau seront ajoutés à 20 ul de plasma, mélangés puis centrifugés à l'aide de filtres Nanosep (10 kDa). Le filtrat sera ensuite injecté dans une HPLC (Agilent Technologies, USA) couplée à un détecteur UV. La séparation chromatographique sera réalisée à l'aide de colonnes Zorbax SB-C8 de 250 mm dans des conditions isocratiques où 2 mM de NH4H2PO4 (pH 2,95) seront utilisés pour la phase mobile. La surface du pic d'acide urique élué sera mesurée et la concentration déterminée par rapport à la courbe d'étalonnage linéaire construite avec les échantillons dopés avec de l'urate pur.

Paramètres cliniques des indices sériques et hématologiques

La glycémie, l'HbA1c et l'insuline, la hsCRP sérique, le cholestérol, les LDL, les HDL, les triglycérides et le fer seront mesurés à l'aide de l'analyseur Cobas C111 (Roche Diagnostics, Suisse). Les taux sériques de zinc et de cuivre seront déterminés au laboratoire de référence de l'hôpital général de Singapour, et la numération des globules blancs et rouges, l'hémoglobine, les concentrations d'hématocrite, les plaquettes, les neutrophiles et les lymphocytes seront évalués à l'aide de l'analyseur de numération globulaire complète (Sysmex, Japon) .

Indices vasculaires

La technique d'analyse des ondes de pouls sera utilisée pour déterminer la pression aortique et l'indice d'augmentation (AIx). Les enregistrements de la vitesse de l'onde de pouls seront effectués à partir de l'artère radiale à l'aide d'un tonomètre Millar, et les données seront collectées et analysées à l'aide du SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australie), qui a permis l'enregistrement continu de la pression artérielle radiale forme d'onde. L'AIx sera calculé en divisant la différence de pression entre les premier et deuxième pics systoliques de la forme d'onde de pression aortique par la pression pulsée aortique calculée.

La mesure du plasma nitrate/nitrite sera adaptée de celle de Tsikas. En bref, à 200 µl de marqueur lourd plasma 15N NO3- et 15N NO2- seront ajoutés, 800 µl d'acétone et 100 µl de bromure de pentafluorobenzyle (PFBBr) seront ajoutés, mélangés et incubés à 50°C pendant 60 min. La partie acétone sera évaporée sous azote puis 500 µl de toluène seront ajoutés et mélangés vigoureusement pendant 1 min. L'extrait organique sera obtenu par centrifugation à 2000 rpm pendant 5 min à 4°C. Les échantillons dérivés seront analysés par GC-MS/NCI. Les séparations seront réalisées sur une colonne capillaire en silice fondue recouverte de 5% de phényl méthyl siloxane réticulé. Les échantillons dérivés (1 µl) seront injectés dans le port d'injection du GC en utilisant un mode sans division. La quantification des nitrates/nitrites sera calculée en comparant la surface du pic de chaque composé avec l'étalon interne fortement marqué pertinent 15N NO3- et 15N NO2-.

analyses statistiques

L'analyse statistique sera effectuée à l'aide de GraphPad Prism version 5.0 pour Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, USA). Toutes les valeurs seront exprimées en SD moyen. Le test t de Student jumelé sera effectué entre la ligne de base et chaque point dans le temps pendant la supplémentation et après la période de sevrage. Tout changement significatif détecté par le test t de Student sera confirmé par ANOVA avec des mesures répétées pour évaluer les effets du zinc au fil du temps.