Zinksuppletie bij diabetes type 2

Studie deelnemers

Veertig mannelijke type 2 diabetici, gerekruteerd uit de polikliniek van het National University Hospital, Singapore, zullen worden gerandomiseerd om twee tabletten van ofwel 100 mg zinkgluconaat (GNC, VS) of placebo (99% microkristallijne cellulose, 1% magnesiumstearaat) te krijgen. per dag gedurende 3 maanden. Proefpersonen van 21 jaar en ouder die voldeden aan de criteria van de American Diabetes Association voor de diagnose van diabetes mellitus type 2 zullen in dit onderzoek worden opgenomen. We zullen diegenen uitsluiten die: vrij verkrijgbare of voorgeschreven medicijnen, vitamine-/mineralensupplementen of traditionele Chinese remedies hadden gebruikt, minder dan 30 dagen voorafgaand aan de start van het onderzoek een acute infectie hadden opgelopen, bij wie de diagnose actieve neuropsychiatrische ziekte of hematologische ziekten, een hemoglobinegehalte van minder dan 10 g/dl, eerder gebruik van verdovende middelen of regelmatig alcoholgebruik van meer dan 14 eenheden per week. Elke deelnemer zal schriftelijke geïnformeerde toestemming geven voorafgaand aan hun deelname aan dit onderzoek.

Suppletie en monstername van bloed en urine

Een onderzoeksapotheker van het ziekenhuis zal worden ingeschakeld om de toegewezen behandelingsgroepen willekeurig te verdelen, te blinderen en de resterende tabletten te tellen om de therapietrouw te beoordelen. Bloed- en spot-urinemonsters worden genomen na 8 uur vasten bij baseline (vóór suppletie), dag 3 en 7, maanden 1, 2 en 3 tijdens suppletie en 1 maand na inname van zink of placebo (wash-out). Een aliquot bloed zal worden verzameld in gewone of EDTA-buisjes voor respectievelijk serum- of plasmascheiding.

Markers van oxidatieve schade

Bloedmonsters die in EDTA-buisjes zijn verzameld, worden gecentrifugeerd, indomethacine en gebutyleerd hydroxytolueen worden aan het plasma toegevoegd en verse urinemonsters worden in polypropyleen buisjes geplaatst. De voorbereide monsters worden tot analyse bij -80oC bewaard. Oxidatieve stress-gerelateerde biomarkers, F2-IsoP's, F4-NP's, HETE's, COP's en allantoïne, zullen worden gemeten door middel van gaschromatografie-massaspectrometrie met behulp van methoden zoals eerder beschreven. In het kort, gemengde zware isotopen, 8-iso-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (geschenk van prof. Jason D. Morrow (overleden), Eiscosanoid Core Laboratory aan de Vanderbilt University), 5(S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 en arachidonzuur-d8 en docosahexaeenzuur-d5, en 7-OH cholesterol-d7, 24- OH cholesterol-d7 en 26 (27)-OH cholesterol-d5 en 7-keto-cholesterol-d7 zullen aan plasma worden toegevoegd voor kwantificering van de oxidatieve stressmarkers. Om de totale (vrije en veresterde) vormen van F2-IsoPs-, F4-NPs- en HETEs-producten te meten, wordt 1 M kaliumhydroxide bereid in methanol toegevoegd aan plasma (1:1) en wordt hydrolyse uitgevoerd bij 37oC gedurende 30 minuten. Daarna worden achtereenvolgens methanol, 5 M HC1 en 40 mM mierenzuur (pH 4,6) toegevoegd en gemengd. Het plasmamengsel wordt vervolgens gezuiverd met behulp van vaste-fase-extractie met anionenuitwisseling (SPE). Om de vrije vormen in plasma en urine (F2-IsoPs en HETEs) te meten, wordt 40 mM mierenzuur (pH 4,5) aan het plasma- of urinemonster toegevoegd, gemengd en vervolgens gezuiverd door SPE. De creatininespiegels in de urine zullen worden gemeten om F2-IsoP's en HETE's in de urine te standaardiseren (Sigma Diagnostic kit, VS).

De gezuiverde monsters worden vervolgens gederivatiseerd en geanalyseerd met behulp van gaschromatografie (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, VS) gekoppeld aan een massaselectieve detector (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, VS) (GC-MS). Voor F2-IsoP's, F4-NP's, HETE's (een mengsel van 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- en 20-HETE's), en metingen van totaal arachidonaat en totaal docosahexanoaat, negatieve chemische ionisatie (NCI ) modus zal worden toegepast en chromatografische scheidingen zullen worden uitgevoerd op een capillaire kolom van gesmolten siliciumdioxide bekleed met verknoopt 5% fenylmethylsiloxaan (HP-5, Agilent Technologies, VS). Om COP's te bepalen, zal de elektronen-ionisatiemodus worden toegepast en zullen chromatografische scheidingen worden uitgevoerd op een capillaire kolom van gesmolten siliciumdioxide bekleed met verknoopt 5% fenylmethylsiloxaan (Ultra 2 J&W, VS). Concentraties van de lipide-oxidatieproducten zullen worden berekend door het piekoppervlak van elke verbinding te vergelijken met de relevante gedeutereerde interne standaard.

Voor allantoïne- en uraatanalyse wordt 25 µl plasma gecentrifugeerd met behulp van Nanosep-filters (10 kDa) en aan het filtraat worden 25 µl 4 mM 15N allantoïne en 100 µl acetonitril toegevoegd, gemengd en vervolgens gedroogd onder stikstofgas. Het gedroogde monster wordt vervolgens gederivatiseerd met 50 ml N-(butyl-dimethyl-silyl)-2,2,2-trifluor-N-methyl-acetamide (MTBSTFA) in pyridine (1:1 v/v) bij 50oC gedurende 2 H. Allantoïne zal worden geanalyseerd door GC-MS. Scheidingen zullen worden uitgevoerd op een capillaire kolom van gesmolten siliciumdioxide bekleed met verknoopt 5% fenylmethylsiloxaan (Ultra 2, Agilent, VS). Gederivatiseerde allantoïnemonsters (1 µl) zullen in de GC-MS worden geïnjecteerd. Kwantificering van allantoïne zal worden berekend door vergelijking met de zware isotoop.

Voor uraatanalyse wordt 80 µl water toegevoegd aan 20 µl plasma, gemengd en vervolgens gecentrifugeerd met behulp van Nanosep-filters (10 kDa). Het filtraat wordt vervolgens geïnjecteerd in een HPLC (Agilent Technologies, VS) gekoppeld aan een UV-detector. Chromatografische scheiding zal worden bereikt met behulp van Zorbax SB-C8-kolommen van 250 mm onder isocratische omstandigheden waarbij 2 mM NH4H2PO4 (pH 2,95) zal worden gebruikt voor de mobiele fase. Het oppervlak van de geëlueerde urinezuurpiek zal worden gemeten en de concentratie zal worden bepaald aan de hand van de lineaire kalibratiecurve die is opgesteld met de monsters verrijkt met zuiver uraat.

Klinische parameters van serum en hematologische indices

Bloedglucose, HbA1c en insuline, serum hsCRP, cholesterol, LDL, HDL, triglyceride en ijzer worden gemeten met behulp van de Cobas C111-analysator (Roche Diagnostics, Zwitserland). Serumzink- en kopergehalten worden bepaald in het verwijzingslaboratorium van het Singapore General Hospital, en witte en rode bloedcellen, hemoglobine, hematocrietconcentraties, bloedplaatjes, neutrofielen en lymfocyten worden beoordeeld met behulp van de Full Blood Count Analyzer (Sysmex, Japan) .

Vasculaire indices

De techniek van pulsgolfanalyse zal worden gebruikt om de aortadruk en augmentatie-index (AIx) te bepalen. Pulsgolfsnelheidsregistraties zullen worden gemaakt van de radiale slagader met behulp van een Millar-tonometer, en gegevens zullen worden verzameld en geanalyseerd met behulp van de SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australië), waarmee continue registratie van de radiale slagaderdruk mogelijk was golfvorm. De AIx wordt berekend door het verschil in druk tussen de eerste en tweede systolische piek van de aortadrukgolfvorm te delen door de berekende aortapulsdruk.

Meting van plasma nitraat/nitriet zal worden aangepast van die van Tsikas. In het kort, aan 200 µl plasma zwaar label 15N NO3- en 15N NO2- worden toegevoegd, 800 µl aceton en 100 µl pentafluorbenzylbromide (PFBBr) worden toegevoegd, gemengd en gedurende 60 minuten bij 50°C geïncubeerd. Het acetongedeelte wordt onder stikstof verdampt en vervolgens wordt 500 µl tolueen toegevoegd en krachtig gemengd gedurende 1 minuut. Het organische extract wordt verkregen door gedurende 5 min bij 4°C te centrifugeren bij 2000 rpm. Gederivatiseerde monsters zullen worden geanalyseerd door GC-MS/NCI. Scheidingen zullen worden uitgevoerd op een capillaire kolom van gesmolten siliciumdioxide, bekleed met verknoopt 5% fenylmethylsiloxaan. Gederivatiseerde monsters (1 µl) zullen in de GC-injectiepoort worden geïnjecteerd met behulp van een splitless-modus. Kwantificering van nitraat/nitriet zal worden berekend door het piekoppervlak van elke verbinding te vergelijken met de relevante zwaar gelabelde interne standaard 15N NO3- en 15N NO2-.

statistische analyse

Statistische analyse zal worden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism versie 5.0 voor Macintosh (GraphPad Prism Software, CA, VS). Alle waarden worden uitgedrukt als gemiddelde SD. De t-test van de gepaarde student wordt uitgevoerd tussen de basislijn en elk tijdstip tijdens de suppletie en na de uitwasperiode. Alle significante veranderingen die door Student's t-test worden gedetecteerd, worden bevestigd door ANOVA met herhaalde metingen om de effecten van zink in de loop van de tijd te beoordelen.