Suplementacja cynku w cukrzycy typu 2

Uczestnicy badania

Czterdziestu mężczyzn z cukrzycą typu 2, rekrutowanych z ambulatorium w National University Hospital w Singapurze, zostanie losowo przydzielonych do grupy otrzymującej dwie tabletki 100 mg glukonianu cynku (GNC, USA) lub placebo (99% celulozy mikrokrystalicznej, 1% stearynianu magnezu) dziennie przez 3 miesiące. Pacjenci w wieku 21 lat i starsi, którzy spełnili kryteria Amerykańskiego Towarzystwa Diabetologicznego dotyczące rozpoznania cukrzycy typu 2, zostaną włączeni do tego badania. Wykluczymy osoby, które: przyjmowały leki dostępne bez recepty lub na receptę, suplementy witaminowo-mineralne lub tradycyjne chińskie leki, przeszły ostrą infekcję mniej niż 30 dni przed rozpoczęciem badania, zdiagnozowano u nich czynną chorobę neuropsychiatryczną lub hematologiczne choroby, miał hemoglobinę poniżej 10 g/dl, stosował wcześniej środki odurzające lub regularnie spożywał alkohol w ilości przekraczającej 14 jednostek tygodniowo. Każdy uczestnik dostarczy pisemną świadomą zgodę przed udziałem w tym badaniu.

Suplementacja i pobieranie krwi i moczu

Farmaceuta szpitalny zostanie zaangażowany do randomizacji, zaślepienia przypisanych grup terapeutycznych i policzenia pozostałych tabletek w celu oceny zgodności. Próbki krwi i moczu zostaną pobrane po 8-godzinnym poście na początku badania (przed suplementacją), w dniach 3 i 7, w 1, 2 i 3 miesiącu podczas suplementacji oraz 1 miesiąc po przyjęciu cynku lub placebo (wypłukanie). Porcja krwi zostanie pobrana do probówek zwykłych lub EDTA w celu oddzielenia odpowiednio surowicy lub osocza.

Markery uszkodzeń oksydacyjnych

Próbki krwi pobrane do probówek z EDTA zostaną odwirowane, do osocza zostanie dodany indometacyna i butylowany hydroksytoluen, a świeże próbki moczu zostaną umieszczone w probówkach polipropylenowych. Przygotowane próbki do czasu analizy będą przechowywane w temperaturze -80oC. Biomarkery związane ze stresem oksydacyjnym, F2-IsoP, F4-NP, HETE, COP i alantoina, zostaną zmierzone za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas przy użyciu metod opisanych wcześniej. W skrócie, mieszane ciężkie izotopy, 8-izo-PGF2α-d4, IPF2α-VI-d4, [18O2] F4-NP (prezent od prof. Jasona D. Morrowa (nieżyjącego), Eiscosanoid Core Laboratory na Vanderbilt University), 5 (S )-HETE-d8, 12(S)-HETE-d8, 15(S)-HETE-d8, 20-HETE-d6 i kwas arachidonowy-d8 i kwas dokozaheksaenowy-d5 oraz 7-OH cholesterol-d7, 24- OH cholesterol-d7 i 26(27)-OH cholesterol-d5 i 7-keto-cholesterol-d7 zostaną dodane do osocza w celu ilościowego oznaczenia markerów stresu oksydacyjnego. W celu pomiaru całkowitych (wolnych i zestryfikowanych) form produktów F2-IsoPs, F4-NPs i HETEs, do osocza dodaje się 1 M wodorotlenek potasu przygotowany w metanolu (1:1) i przeprowadza hydrolizę w temperaturze 37oC przez 30 minut. Następnie kolejno dodaje się metanol, 5 M HCl i 40 mM kwas mrówkowy (pH 4,6) i miesza. Mieszanka osocza zostanie następnie oczyszczona przy użyciu anionowymiennej ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Aby zmierzyć wolne formy w osoczu i moczu (F2-IsoP i HETE), do próbki osocza lub moczu dodaje się 40 mM kwasu mrówkowego (pH 4,5), miesza, a następnie oczyszcza metodą SPE. Poziomy kreatyniny w moczu będą mierzone w celu standaryzacji F2-IsoP i HETE w moczu (zestaw Sigma Diagnostic, USA).

Oczyszczone próbki będą następnie derywatyzowane i analizowane przy użyciu chromatografii gazowej (Hewlett-Packard 6890, Agilent Technologies, USA) sprzężonej z selektywnym detektorem masowym (Hewlett-Packard 5973N, Agilent Technologies, USA) (GC-MS). W przypadku pomiarów F2-IsoP, F4-NPs, HETE (mieszanina 5(S)-, 12(S)-, 15(S)- i 20-HETE) oraz całkowitego arachidonianu i całkowitego dokozaheksanianu, ujemna jonizacja chemiczna (NCI ) i rozdziały chromatograficzne zostaną przeprowadzone na kolumnie kapilarnej ze stopionej krzemionki pokrytej usieciowanym 5% fenylometylosiloksanem (HP-5, Agilent Technologies, USA). W celu określenia COP zostanie zastosowany tryb jonizacji elektronowej i przeprowadzone rozdziały chromatograficzne na kolumnie kapilarnej z topionej krzemionki pokrytej usieciowanym 5% fenylometylosiloksanem (Ultra 2 J&W, USA). Stężenia produktów utleniania lipidów zostaną obliczone przez porównanie powierzchni piku każdego związku z odpowiednim deuterowanym standardem wewnętrznym.

Do analizy alantoiny i moczanów, 25 ul osocza odwiruje się stosując filtry Nanosep (10 kDa) i do przesączu doda się 25 ul 4 mM 15N alantoiny i 100 ul acetonitrylu, zmiesza, a następnie wysuszy pod gazowym azotem. Wysuszona próbka zostanie następnie derywatyzowana za pomocą 50 ml N-(butylo-dimetylo-sililo)-2,2,2-trifluoro-N-metylo-acetamidu (MTBSTFA) w pirydynie (1:1 v/v) w 50oC przez 2 H. Alantoina zostanie przeanalizowana metodą GC-MS. Rozdziały zostaną przeprowadzone na kolumnie kapilarnej z topionej krzemionki pokrytej usieciowanym 5% fenylometylosiloksanem (Ultra 2, Agilent, USA). Próbki derywatyzowanej alantoiny (1 µl) zostaną wstrzyknięte do GC-MS. Oznaczenie ilościowe alantoiny zostanie obliczone przez porównanie z ciężkim izotopem.

Do analizy moczanów do 20 ul osocza dodaje się 80 ul wody, miesza, a następnie odwirowuje stosując filtry Nanosep (10 kDa). Filtrat zostanie następnie wstrzyknięty do HPLC (Agilent Technologies, USA) połączonej z detektorem UV. Rozdział chromatograficzny zostanie osiągnięty przy użyciu 250 mm kolumn Zorbax SB-C8 w warunkach izokratycznych, gdzie jako fazę ruchomą zostanie użyty 2 mM NH4H2PO4 (pH 2,95). Powierzchnia piku wymytego kwasu moczowego zostanie zmierzona, a stężenie określone w oparciu o liniową krzywą kalibracji zbudowaną z próbek wzbogaconych czystym moczanem.

Parametry kliniczne surowicy i wskaźniki hematologiczne

Glukoza we krwi, HbA1c i insulina, hsCRP w surowicy, cholesterol, LDL, HDL, trójglicerydy i żelazo zostaną zmierzone za pomocą analizatora Cobas C111 (Roche Diagnostics, Szwajcaria). Poziom cynku i miedzi w surowicy zostanie określony w Laboratorium Referencyjnym Szpitala Ogólnego w Singapurze, a liczba białych i czerwonych krwinek, hemoglobina, stężenie hematokrytu, płytek krwi, neutrofili i limfocytów zostanie oceniona za pomocą analizatora pełnej morfologii krwi (Sysmex, Japonia) .

Wskaźniki naczyniowe

Technika analizy fali tętna zostanie wykorzystana do określenia ciśnienia w aorcie oraz wskaźnika augmentacji (AIx). Rejestracja prędkości fali tętna zostanie wykonana z tętnicy promieniowej za pomocą tonometru Millara, a dane zostaną zebrane i przeanalizowane za pomocą SphygmoCor (SphygmoCor 2000 v7.0, PWV Medical, Sydney, Australia), co umożliwiło ciągłą rejestrację ciśnienia w tętnicy promieniowej kształt fali. AIx zostanie obliczone poprzez podzielenie różnicy ciśnień między pierwszym i drugim pikiem skurczowym krzywej ciśnienia w aorcie przez obliczone ciśnienie tętna w aorcie.

Pomiar azotanów/azotynów w osoczu zostanie zaadaptowany z pomiaru Tsikasa. W skrócie, do 200 µl osocza ciężkiego znacznika 15N NO3- i 15N NO2- zostanie dodane, 800 µl acetonu i 100 µl bromku pentafluorobenzylu (PFBBr), zmieszane i inkubowane w 50°C przez 60 min. Porcję acetonową odparowuje się w atmosferze azotu, a następnie dodaje się 500 µl toluenu i energicznie miesza przez 1 min. Ekstrakt organiczny otrzyma się przez wirowanie przy 2000 obr/min przez 5 min w 4°C. Derywatyzowane próbki będą analizowane metodą GC-MS/NCI. Rozdziały będą prowadzone na kolumnie kapilarnej z topionej krzemionki pokrytej usieciowanym 5% fenylometylosiloksanem. Derywatyzowane próbki (1 μl) zostaną wstrzyknięte do portu wstrzykiwania GC przy użyciu trybu bez podziału. Oznaczenie ilościowe azotanów/azotynów zostanie obliczone przez porównanie powierzchni piku każdego związku z odpowiednim silnie oznakowanym wzorcem wewnętrznym 15N NO3- i 15N NO2-.

Analizy statystyczne

Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism w wersji 5.0 dla komputerów Macintosh (oprogramowanie GraphPad Prism, CA, USA). Wszystkie wartości zostaną wyrażone jako średnia SD. Sparowany test t-Studenta zostanie przeprowadzony między linią bazową a każdym punktem czasowym podczas suplementacji i po okresie wypłukiwania. Wszelkie znaczące zmiany wykryte przez test t-Studenta zostaną potwierdzone przez ANOVA z powtarzanymi pomiarami w celu oceny wpływu cynku w czasie.