말레이시아 성인의 치주질환과 당뇨병의 상관관계

University Malaya Medical Center(MEC Ref No: 696.9)와 University Malaya Dental Center[DF PE1002/0045(P)]의 의료 윤리 위원회에서 윤리적 승인을 받았습니다. 30세에서 70세 사이의 제2형 당뇨병 환자(연구 최소 1년 전에 진단됨) 112명이 말라야 대학 의료 센터의 외래 환자 당뇨병 클리닉에서 선별되었으며 포함 및 제외를 충족한 총 40명의 환자 연구를 위해 기준을 모집했습니다. 모집된 환자는 말라야 대학교 치의학부 치주과 클리닉에 등록되었습니다. 연구에 관한 환자 정보 시트 및 구두 설명이 모든 환자에게 제공되었습니다. 언제든지 연구에서 철회할 수 있다는 이해와 함께 모집된 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 환자 선별 및 치료는 2010년 1월부터 2011년 12월까지 시작되었습니다.

샘플 크기 계산은 치료군당 15명의 피험자가 테스트와 대조군 사이의 HbA1c 변화의 최소 차이 1%(11.0mmol/mol)를 감지하는 데 80% 검정력을 제공할 것이라고 결정했습니다. 따라서 연구 기간 동안 발생할 수 있는 탈락 가능성을 보상하기 위해 팔당 20명의 피험자(총 40명)의 샘플을 모집했습니다.

모든 환자는 동전 던지기를 통해 연령 일치 NSPT 및 OHE 그룹에 무작위로 배정되었습니다. 조사자 1은 참가자를 선별 및 등록하고 연령 일치 그룹에 할당했습니다. 조사자 2는 동전 던지기 방법을 사용하여 무작위 할당 순서를 수행하여 조사자 1이 모든 개입을 수행하는 동안 참가자를 다른 개입에 할당했습니다. 참가자 또는 심사관의 눈이 멀지 않았습니다.

한 명의 검사자만 연구에 참여했기 때문에 검사자가 사용된 임상 매개변수의 정량적 결과 측정을 지속적으로 재현할 수 있는 능력을 검증하기 위해 검사자 내 신뢰도 평가를 실행했습니다. 약 3시간 간격으로 Plaque Index(PI), Gingival Bleeding Index(GBI), Probing Pocket Depth(PPD), Probing Attachment Loss(PAL)를 측정하였다. Kappa 통계를 활용하여 기록된 모든 임상 매개변수의 재현성에 대해 좋은 일치(>0.8)를 얻었습니다.

모집된 모든 환자는 기준선, 할당된 치료 후 2개월 및 할당된 치료 후 3개월에 전체 치주 평가를 받았습니다. 임상 검사에는 플라크 지수(PI), 치은 출혈 지수(GBI), 프로빙 포켓 깊이(PPD) 및 전자식 항력 탐침(Florida Probe®)으로 측정한 PAL(Probing Attachment Loss)이 포함되었습니다.

모든 환자에게 변형된 Bass 기법을 활용한 부드러운 모의 칫솔, 소형 다발 칫솔, 치간 칫솔 및 치실을 사용하여 구강 위생 방법을 교육했습니다. 초음파 스케일러와 Gracey 큐렛을 사용하여 NSPT 그룹의 모든 피험자를 대상으로 스케일링과 치근 활택으로 구성된 전체 구강 괴사 조직 제거를 한 번 방문하여 수행했습니다. 또한 NSPT 그룹의 모든 환자에게 0.12% 클로르헥시딘 구강청결제(Hexipro®)를 제공했습니다. 그들은 전체 구강 조직 제거 완료 직후부터 시작하여 14일 동안 매번 15ml를 사용하여 하루에 세 번 헹구도록 지시받았습니다. 그 후 각 리콜 방문에서 모든 참가자는 다시 동기를 부여받았고 테스트 그룹에 있는 사람들에 대해 전문적인 예방 조치가 수행되었습니다.

기준선, 치료 전 및 지정된 치료 후 3개월에 각 환자로부터 15ml의 정맥혈을 수집했습니다. 글리코실화된 헤모글로빈(HbA1c) 및 전신 hs-C-반응성 단백질(hs-CRP)의 수준을 평가했습니다. Hs-CRP 수준은 고감도 CRP(hs-CRP)에 대한 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 모든 혈액 조사는 개인 실험실(Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) 치주과 소속 없음. HbA1c 테스트는 DCCT에 맞춰져 있으며 실험실의 품질 보증은 Bio-Rad Laboratories(미국), EQAS(외부 품질 보증 서비스)에서 인증되었습니다.

가장 깊은 포켓을 식별하고(PPD ≥ 5 mm인 최소 5개의 포켓) 면봉으로 분리했습니다. 그런 다음 면 펠릿과 큐렛을 사용하여 치은연상 플라크를 조심스럽게 제거했습니다. 이어서 치은연하 플라크 샘플을 멸균 큐렛을 사용하여 수집하고 1ml 인산염 완충액(PBS)이 들어 있는 멸균 DNAse 및 RNase가 없는 폴리에틸렌 튜브에 모으고 q-PCR 분석이 시작될 때까지 -800C에서 동결했습니다.

실험실에서 QIAcube 기계(Qiagen®)를 사용하여 자동 DNA 추출을 수행했습니다. 플라크 시료 100㎕를 1.5ml 원심분리관에 넣고 탁상 원심분리기에서 5,000×g의 속도로 10분간 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 그런 다음 펠릿을 DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit 및 QIAmp® DNA 액세서리 세트를 사용하여 QIAcube 기계로 자동 DNA 추출을 위해 QIAcube-shaker에 놓았습니다. 키트에 제공된 모든 시약은 프로세스 시작 전에 기계의 시약 병 랙에 수동으로 배치되었습니다. 마지막으로 기기의 프로토콜 목록에서 "Bacterial DNA" 프로토콜을 선택했습니다. 간단히 말해서, Qiacube 기계는 용해, 배양, 결합, 세척 및 용출 프로세스를 포함하는 5개의 연속 단계를 거쳤습니다. 프로세스가 끝나면 100µl의 용출된 DNA를 사용할 수 있습니다. 추출된 DNA는 Nanodrop 기계를 사용하여 농도 및 순도에 대해 테스트되었습니다. 그런 다음 DNA는 q-PCR 기계를 사용하여 박테리아 식별 전에 -80⁰C에 보관되었습니다.

추출된 DNA의 농도와 순도는 PC 기반 소프트웨어와 연결된 분광광도계(Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers)를 사용하여 결정되었습니다. 0.1 μl의 용출된 DNA를 하부 받침대 암에 피펫팅했습니다. 광섬유 케이블(수신 광섬유)이 이 받침대에 내장되어 있습니다. 상부 받침대 암에 위치한 두 번째 광섬유 케이블(소스 광섬유)은 액체 샘플과 접촉하여 액체가 두 광섬유의 끝 사이의 간격을 연결합니다. 펄스 크세논 플래시 램프는 광원을 제공하고 선형 CCD 어레이를 활용하는 분광계는 샘플을 통과하는 빛을 분석합니다. 플라크 샘플과 참조 균주의 DNA 농도를 측정하고 그에 따라 기록했습니다. 추출된 DNA는 결국 q-PCR 절차가 시작될 때까지 -20⁰C에 보관되었습니다.

플라크 샘플에서 P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia 및 T.forsythia의 검출 및 정량화는 PC 기반 소프트웨어에 연결된 Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 박테리아 기준 균주의 알려진 양(농도)의 표준 곡선에 샘플의 주기 역치(Ct) 값을 투영하여 정량화를 수행했습니다.

이를 위해 추출된 박테리아의 DNA를 기지량으로 연속 희석(10배 희석)하여 RT-PCR 증폭을 수행하였다. 이는 q-PCR을 사용하여 플라크 샘플에서 DNA를 증폭하기 전에 표준 곡선을 제공하기 위해 수행되었습니다. 정량화를 위한 최적의 표준 곡선을 얻기 위해 최적화를 수행했습니다. R2 값이 0.956인 참조 균주(10ng/μl-0.0001ng/μl 범위)의 최종 10배 희석 표준 곡선을 정량화를 위한 기준으로 사용했습니다.

q-PCR 기술의 민감도를 결정하기 위해 알려진 농도의 개별 미생물을 포함하는 일련의 샘플을 q-PCR 분석을 위해 처리했습니다. 양성 PCR 산물을 초래하는 가장 낮은 농도를 검정의 민감도로 간주하였다.

q-PCR 증폭은 총 반응 혼합물 부피 20μl에서 수행되었습니다. 이 혼합물에는 PCR 주형 역할을 하는 플라크 샘플/기준 균주의 정제된 DNA 2µl, 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix(PCR 버퍼, dNTP's, Amplitaq Gold, 기준 신호, 우라실 N-글리코실라아제, MgCl2; Applied Bio 10µl)가 포함되어 있습니다. systems, Foster City, CA, USA), Custom Taqman® Gene Expression Assay(20x) 1µl 및 뉴클레아제가 없는 물 7µl. 절차는 96-웰 반응 플레이트를 사용하여 수행되었습니다.

반응 혼합물의 모든 성분(DNA 샘플 제외)을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 첨가했습니다. 튜브에 캡을 씌우고 짧게 와동시켰다. 그런 다음 튜브를 원심분리하여 내용물을 스핀다운하고 기포를 제거했습니다. 그런 다음 혼합물을 96웰 반응 플레이트로 옮기고 2μl DNA 샘플을 첨가했습니다. 전체 웰을 차지한 후 반응 플레이트를 광학 접착 커버로 덮었습니다. 이 반응 플레이트를 다시 짧게 원심분리하여 내용물을 스핀 다운하고 모든 기포가 확실히 제거되도록 했습니다.

그런 다음 이 혼합물을 50ºC에서 2분, 95ºC에서 10분간의 초기 증폭 주기에 적용한 다음 95ºC에서 15초 및 60ºC에서 1분간 45주기를 수행했습니다. 각 샘플에 대한 q-PCR 증폭 플롯을 분석하여 Ct 값을 결정했습니다. 그런 다음 정량화를 위해 Ct 값을 기준 변형률의 표준 곡선에 투영했습니다.

PI, GBI, PPD(%) 및 PAL(%)의 변화를 카이제곱 테스트를 사용하여 비교했습니다. P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia 및 T.forsythia의 평균 PPD, 평균 PAL, 평균 HbA1c, 평균 CRP 및 검출 빈도에 대한 그룹 내 비교는 쌍을 이룬 샘플 t-테스트로 평가되었지만 동일한 변수에 대한 그룹 간 비교는 독립적인 샘플 t-테스트를 ​​사용하여 수행되었습니다.