La relation entre la maladie parodontale et le diabète sucré chez les Malaisiens adultes

L'approbation éthique a été obtenue à la fois des comités d'éthique médicale du centre médical universitaire de Malaya (MEC Ref No: 696.9) et du centre dentaire universitaire de Malaya [DF PE1002/0045(P)]. Cent douze patients diabétiques de type 2 (diagnostiqués au moins 1 an avant l'étude) âgés de 30 à 70 ans ont été dépistés à la clinique ambulatoire du diabète du centre médical universitaire de Malaya et un total de 40 patients ont rempli les critères d'inclusion et d'exclusion. critères ont été recrutés pour l'étude. Les patients recrutés ont ensuite été inscrits à la clinique de parodontologie de la faculté de médecine dentaire de l'université de Malaya. Des fiches d'information aux patients concernant l'étude et des explications verbales ont été données à tous les patients. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients recrutés, étant entendu qu'ils pouvaient se retirer de l'étude à tout moment. Le dépistage et le traitement des patients ont commencé de janvier 2010 à décembre 2011.

Le calcul de la taille de l'échantillon a déterminé que 15 sujets par bras de traitement fourniraient 80 % de puissance pour détecter une différence minimale de 1 % (11,0 mmol/mol) de variation de l'HbA1c entre le test et le contrôle. En conséquence, un échantillon de 20 sujets par bras (40 au total) a été recruté pour compenser les éventuels abandons pendant la période d'étude.

Tous les patients ont été assignés au hasard via un tirage au sort à des groupes NSPT et OHE appariés selon l'âge. L'investigateur 1 a sélectionné et inscrit les participants et les a assignés à des groupes appariés selon l'âge. L'enquêteur 2 a effectué la séquence d'attribution aléatoire en utilisant la méthode du tirage au sort pour affecter les participants aux différentes interventions tandis que l'enquêteur 1 a effectué toutes les interventions. Il n'y avait pas de mise en aveugle des participants ou de l'examinateur.

Comme un seul examinateur était impliqué dans l'étude, une évaluation de la fiabilité intra-examinateur a été effectuée pour valider la capacité de l'examinateur à reproduire en permanence les mesures quantitatives des résultats des paramètres cliniques utilisés. L'indice de plaque (PI), l'indice de saignement gingival (GBI), la profondeur de la poche de sondage (PPD) et la perte d'attachement au sondage (PAL) ont été mesurés dans un intervalle de temps d'environ 3 heures. En utilisant les statistiques Kappa, de bons accords (>0,8) ont été obtenus pour la reproductibilité de tous les paramètres cliniques enregistrés.

Tous les patients recrutés ont subi une évaluation parodontale complète au départ, 2 mois après le traitement assigné et 3 mois après le traitement assigné. L'examen clinique comprenait l'indice de plaque (PI), l'indice de saignement gingival (GBI), la profondeur de poche au sondage (PPD) et la perte d'attachement au sondage (PAL) mesurés avec une sonde électronique à force constante (Florida Probe®).

Tous les patients ont reçu des instructions sur les méthodes d'hygiène bucco-dentaire à l'aide d'une brosse à dents à poils souples, d'une brosse à dents à touffe compacte, de brosses interdentaires et de fil dentaire utilisant la technique de Bass modifiée. Le débridement complet de la bouche, qui consistait en un détartrage et un surfaçage radiculaire, a été effectué en une seule visite pour tous les sujets du groupe NSPT à l'aide d'un détartreur à ultrasons et de curettes Gracey. De plus, tous les patients du groupe NSPT ont reçu un bain de bouche à la chlorhexidine à 0,12 % (Hexipro®). On leur a demandé de rincer trois fois par jour en utilisant 15 ml à chaque fois pendant une période de 14 jours commençant immédiatement après la fin du débridement complet de la bouche. Par la suite, à chaque visite de rappel, tous les participants ont été remotivés et une prophylaxie professionnelle a été effectuée sur ceux du groupe test.

15 ml de sang veineux ont été prélevés sur chaque patient au départ, avant le traitement et 3 mois après les traitements assignés. Les taux d'hémoglobine glycosylée (HbA1c) et de protéine hs-C-réactive systémique (hs-CRP) ont été évalués. Les niveaux de Hs-CRP ont été évalués à l'aide de tests de CRP à haute sensibilité (hs-CRP). Toutes les analyses de sang ont été effectuées dans un laboratoire privé (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) sans affiliation au Département de parodontologie. Le test HbA1c est aligné DCCT et l'assurance qualité du laboratoire est certifiée par Bio-Rad Laboratories (USA), EQAS (External Quality Assurance Services).

Les poches les plus profondes ont été identifiées (minimum 5 poches avec PPD ≥ 5 mm) et isolées avec des rouleaux de coton. Cela a été suivi d'une élimination soigneuse de la plaque supragingivale à l'aide de boulettes de coton et de curettes. Des échantillons de plaque sous-gingivale ont ensuite été collectés à l'aide de curettes stériles et regroupés dans un tube en polyéthylène stérile sans DNAse et sans RNase contenant 1 ml de solution tampon phosphate (PBS) et congelés à -80 ° C jusqu'au début de l'analyse q-PCR.

L'extraction automatisée de l'ADN a été réalisée en laboratoire à l'aide de la machine QIAcube (Qiagen®). 100 µl d'échantillon de plaque ont été placés dans un tube à centrifuger de 1,5 ml et ont été centrifugés à une vitesse de 5 000 × g pendant 10 minutes sur une centrifugeuse de table pour obtenir un culot. Les culots ont ensuite été placés sur le QIAcube-shaker pour une extraction automatisée de l'ADN par la machine QIAcube à l'aide du DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit et du kit d'accessoires QIAmp® DNA. Tous les réactifs fournis dans le kit ont été placés manuellement dans le porte-bouteilles de réactifs de la machine avant le début du processus. Enfin, le protocole « ADN bactérien » a été sélectionné dans la liste des protocoles de la machine. En bref, la machine Qiacube a subi cinq étapes consécutives qui comprenaient les processus de lyse, d'incubation, de liaison, de lavage et d'élution. A la fin du processus, 100 ul d'ADN élué étaient disponibles. L'ADN extrait a ensuite été testé pour la concentration et la pureté à l'aide de la machine Nanodrop. L'ADN a ensuite été stocké à -80⁰C avant l'identification bactérienne à l'aide d'un appareil q-PCR.

La concentration et la pureté de l'ADN extrait ont été déterminées à l'aide du spectrophotomètre (spectrophotomètres Thermo Scientific NanoDrop™ 2000) qui était connecté à un logiciel basé sur PC. 0,1 µl d'ADN élué a été pipeté sur le bras inférieur du piédestal. Un câble à fibre optique (la fibre réceptrice) est intégré dans ce socle. Un deuxième câble à fibre optique (la fibre source) situé dans le bras du socle supérieur est ensuite mis en contact avec l'échantillon de liquide, ce qui fait que le liquide comble l'espace entre les extrémités des deux fibres. Une lampe flash au xénon pulsé fournit la source de lumière et un spectromètre utilisant un réseau CCD linéaire analyse la lumière traversant l'échantillon. La concentration d'ADN des échantillons de plaque et de la souche de référence a été mesurée et enregistrée en conséquence. Les ADN extraits ont finalement été stockés à -20⁰C jusqu'au début de la procédure de q-PCR.

La détection et la quantification de P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia et T. forsythia à partir d'échantillons de plaque ont été effectuées à l'aide des systèmes de PCR en temps réel Applied Biosystems® 7500 qui étaient connectés à un logiciel basé sur PC. La quantification a été effectuée en projetant la valeur du seuil de cycle (Ct) des échantillons sur la courbe standard de la quantité connue (concentration) de la souche bactérienne de référence.

À cette fin, une quantité connue d'ADN extrait des bactéries a été diluée en série (dilution de 10 fois) et a été soumise à une amplification par RT-PCR. Cela a été fait pour fournir une courbe standard avant l'amplification de l'ADN à partir d'échantillons de plaque à l'aide de la q-PCR. Une optimisation a été effectuée afin d'obtenir la courbe standard optimale pour la quantification. Une courbe standard de dilution finale de 10 fois des souches de référence (plage de 10 ng/µl à 0,0001 ng/µl) avec une valeur R2 de 0,956 a été utilisée comme base pour la quantification.

Pour déterminer la sensibilité de la technique q-PCR, des échantillons en série contenant des concentrations connues de micro-organismes individuels ont été traités pour l'analyse q-PCR. La concentration la plus faible qui a abouti à un produit de PCR positif a été considérée comme la sensibilité du test.

L'amplification q-PCR a été effectuée dans un volume total de mélange réactionnel de 20 µl. Ce mélange contenait 2 µl d'ADN purifié provenant d'un échantillon de plaque/souche de référence pour servir de matrice PCR, 10 µl de 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (tampon PCR, dNTP, Amplitaq Gold, signal de référence, uracile N-glycosylase, MgCl2 ; Applied Bio systems, Foster City, Californie, États-Unis), 1 µl de test d'expression génique Custom Taqman® (20x) et 7 µl d'eau sans nucléase. Les procédures ont été conduites en utilisant des plaques de réaction à 96 puits.

Tous les composants du mélange réactionnel (à l'exception de l'échantillon d'ADN) ont été ajoutés dans un microtube à centrifuger de 1,5 ml. Le tube a été bouché et vortexé brièvement. Les tubes ont ensuite été centrifugés pour centrifuger le contenu et éliminer les bulles d'air. Le mélange a ensuite été transféré dans une plaque de réaction à 96 puits et suivi par l'ajout de 2 pl d'échantillon d'ADN. La plaque de réaction a ensuite été recouverte d'un revêtement adhésif optique après que tout le puits a été occupé. Cette plaque de réaction a de nouveau été brièvement centrifugée pour faire tourner le contenu et s'assurer que toutes les bulles étaient éliminées.

Ce mélange a ensuite été soumis à un cycle d'amplification initial de 50°C pendant 2 minutes et 95°C pendant 10 minutes, suivi de 45 cycles à 95°C pendant 15 s et 60°C pendant 1 minute. Le tracé d'amplification q-PCR pour chaque échantillon a été analysé pour déterminer la valeur Ct. La valeur Ct a ensuite été projetée sur la courbe standard de la souche de référence pour la quantification.

Les comparaisons des changements de PI, GBI, PPD (%) et PAL (%) à la fois au sein et entre les groupes ont été effectuées à l'aide du test du chi carré. La comparaison intragroupe pour la PPD moyenne, la PAL moyenne, l'HbA1c moyenne, la CRP moyenne et la fréquence de détection de P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia et T.forsythia ont été évaluées avec le test t pour échantillons appariés, tandis que les comparaisons intergroupes pour les mêmes variables a été réalisé à l'aide d'un test t d'échantillon indépendant.