Parodontale sygdom og diabetes mellitus indbyrdes sammenhæng blandt voksne malaysere

Etisk godkendelse blev opnået fra både Medical Ethics Boards of University Malaya Medical Center (MEC Ref No: 696.9) og University Malaya Dental Center [DF PE1002/0045(P)]. Et hundrede og tolv type 2 diabetespatienter (diagnosticeret mindst 1 år før undersøgelsen) mellem 30 og 70 år blev screenet fra ambulatoriet Diabetes Clinic ved University Malaya Medical Center og i alt 40 patienter, der opfyldte inklusionen og eksklusionen kriterier blev rekrutteret til undersøgelsen. De rekrutterede patienter blev derefter registreret på Parodontologisk Klinik ved Det Odontologiske Fakultet, University of Malaya. Patientinformationsark vedrørende undersøgelsen og verbale forklaringer blev givet til alle patienter. Informeret samtykke blev indhentet fra alle rekrutterede patienter med den forståelse, at de til enhver tid kunne trække sig fra undersøgelsen. Screening og behandling af patienter startede fra januar 2010 til december 2011.

Prøvestørrelsesberegningen bestemte, at 15 forsøgspersoner pr. behandlingsarm ville give 80 % kraft til at detektere en minimumsforskel på 1 % (11,0 mmol/mol) ændring i HbA1c mellem test og kontrol. Derfor blev en prøve på 20 forsøgspersoner pr. arm (40 i alt) rekrutteret for at kompensere for mulige frafald i undersøgelsesperioden.

Alle patienter blev tilfældigt tildelt via en møntkast til aldersmatchede NSPT- og OHE-grupper. Efterforsker 1 screenede og indskrev deltagere og tildelte dem til aldersmatchede grupper. Undersøger 2 udførte den tilfældige tildelingssekvens ved at bruge møntkastmetoden for at tildele deltagere til de forskellige interventioner, mens undersøger 1 udførte al intervention. Der var ingen blinding af deltagere eller eksaminator.

Da kun én eksaminator var involveret i undersøgelsen, blev der udført intra-eksaminator pålidelighedsvurdering for at validere eksaminatorens evne til konstant at reproducere de kvantitative udfaldsmålinger af de anvendte kliniske parametre. Plaque Index (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) og Probing Attachment Loss (PAL) blev målt i tidsintervallet på ca. 3 timer. Ved at bruge Kappa-statistikker blev der opnået gode overensstemmelser (>0,8) for reproducerbarhed af alle registrerede kliniske parametre.

Alle rekrutterede patienter gennemgik fuld periodontal vurdering ved baseline, 2 måneder efter tildelt behandling og 3 måneder efter tildelt behandling. Den kliniske undersøgelse omfattede Plaque Index (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) og Probing Attachment Loss (PAL) målt med en elektronisk konstant-kraft probe (Florida Probe®).

Alle patienter blev instrueret i mundhygiejnemetoder ved hjælp af en blød tandbørste, en kompakt-toft-tandbørste, inter-dentale børster og tandtråd ved hjælp af den modificerede Bass-teknik. Fuld mund-debridement, som bestod af skæl og rodplaning, blev udført i et enkelt besøg for alle forsøgspersoner i NSPT-gruppen ved hjælp af en ultralydsskaler og Gracey curettes. Derudover fik alle patienter i NSPT-gruppen en 0,12 % klorhexidin-mundskylle (Hexipro®). De blev instrueret i at skylle tre gange om dagen ved at bruge 15 ml hver gang i en periode på 14 dage, der startede umiddelbart efter fuldendelse af debridering af fuld mund. Derefter ved hvert tilbagekaldelsesbesøg blev alle deltagere re-motiveret, og professionel profylakse blev udført på dem i testgruppen.

15 ml venøst ​​blod blev opsamlet fra hver patient ved baseline, før behandling og 3 måneder efter tildelte behandlinger. Niveauer af glykosyleret hæmoglobin (HbA1c) og systemisk hs-C-reaktivt protein (hs-CRP) blev vurderet. Hs-CRP-niveauer blev vurderet ved hjælp af tests for højsensitiv CRP (hs-CRP). Alle blodundersøgelser blev udført på et privat laboratorium (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) uden tilknytning til Parodontologisk Afdeling. HbA1c-testen er DCCT-tilpasset, og laboratoriets kvalitetssikring er certificeret under Bio-Rad Laboratories (USA), EQAS (External Quality Assurance Services).

De dybeste lommer blev identificeret (minimum 5 lommer med PPD ≥ 5 mm) og isoleret med bomuldsruller. Dette blev efterfulgt af omhyggelig fjernelse af supragingival plak ved hjælp af bomuldspellets og curetter. Subgingivale plakprøver blev efterfølgende opsamlet under anvendelse af sterile curetter og samlet i sterilt DNAse-frit og RNase-frit polyethylenrør indeholdende 1 ml phosphatbufferopløsning (PBS) og frosset ved -800°C indtil påbegyndelse af q-PCR-analyse.

Automatiseret DNA-ekstraktion blev udført i laboratoriet ved hjælp af QIAcube-maskinen (Qiagen®). 100 µl plakprøve blev anbragt i et 1,5 ml centrifugerør og blev centrifugeret ved en hastighed på 5.000 x g i 10 minutter på en bordcentrifugemaskine for at opnå en pellet. Pellets blev derefter anbragt på QIAcube-rysteren til automatisk DNA-ekstraktion med QIAcube-maskine ved hjælp af DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit og QIAmp® DNA-tilbehørssæt. Alle reagenser i sættet blev manuelt anbragt i reagensflaskestativet i maskinen før starten af ​​processen. Til sidst blev protokollen "Bakteriel DNA" valgt fra maskinens protokolliste. Kort fortalt gennemgik Qiacube-maskinen fem på hinanden følgende trin, som omfattede lysering, inkubering, binding, vask og elueringsprocesser. Ved afslutningen af ​​processen var 100 µl elueret DNA tilgængelig. Det ekstraherede DNA blev derefter testet for koncentration og renhed ved hjælp af Nanodrop-maskine. DNA'et blev derefter opbevaret i -80°C før bakteriel identifikation ved anvendelse af q-PCR-maskine.

Koncentrationen og renheden af ​​ekstraheret DNA blev bestemt ved anvendelse af spektrofotometermaskinen (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers), som var forbundet med en pc-baseret software. 0,1 µl elueret DNA blev pipetteret på den nedre piedestalarm. Et fiberoptisk kabel (den modtagende fiber) er indlejret i denne piedestal. Et andet fiberoptisk kabel (kildefiberen) placeret i den øvre piedestalarm bringes derefter i kontakt med væskeprøven, hvilket får væsken til at bygge bro mellem enderne af de to fibre. En pulseret xenon-flashlampe giver lyskilden, og et spektrometer, der anvender et lineært CCD-array, analyserer lyset, der passerer gennem prøven. DNA-koncentrationen fra både plakprøver og referencestamme blev målt og registreret i overensstemmelse hermed. De ekstraherede DNA'er blev til sidst opbevaret i -20°C indtil påbegyndelsen af ​​q-PCR-proceduren.

Påvisningen og kvantificeringen af ​​P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia og T.forsythia fra plakprøver blev udført ved anvendelse af Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems, som var forbundet til pc-baseret software. Kvantificeringen blev udført ved at projicere cyklustærskelværdien (Ct) for prøverne på standardkurven for den kendte mængde (koncentration) af bakteriereferencestamme.

Til dette formål blev en kendt mængde ekstraheret DNA fra bakterierne seriefortyndet (10 gange fortynding) og blev underkastet RT-PCR-amplifikation. Dette blev gjort for at tilvejebringe en standardkurve før amplifikation af DNA fra plakprøver ved anvendelse af q-PCR. Optimering blev udført for at få den optimale standardkurve til kvantificering. En endelig 10-folds fortyndingsstandardkurve for referencestammer (interval fra 10 ng/µl-0,0001 ng/µl) med R2-værdi på 0,956 blev anvendt som base for kvantificering.

For at bestemme følsomheden af ​​q-PCR-teknikken blev serielle prøver indeholdende kendte koncentrationer af individuelle mikroorganismer behandlet til q-PCR-analyse. Den laveste koncentration, der resulterede i et positivt PCR-produkt, blev betragtet som assayets følsomhed.

q-PCR-amplifikation blev udført i et totalt reaktionsblandingsvolumen på 20 µl. Denne blanding indeholdt 2 µl oprenset DNA fra plakprøve/referencestamme til at fungere som PCR-skabelon, 10 µl 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (PCR-buffer, dNTP'er, Amplitaq Gold, referencesignal, uracil N-glycosylase, MgCl2; Applied Bio systemer, Foster City, CA, USA), 1µl Custom Taqman®-genekspressionsanalyse (20x) og 7µl nukleasefrit vand. Procedurerne blev udført under anvendelse af 96-brønds reaktionsplader.

Alle komponenterne i reaktionsblandingen (undtagen DNA-prøve) blev tilsat til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Røret blev lukket og vortexet kort. Rørene blev derefter centrifugeret for at dreje indholdet ned og fjerne luftbobler. Blandingen blev derefter overført til en 96-brønds reaktionsplade og efterfulgt af tilsætning af 2 µl DNA-prøve. Reaktionspladen blev derefter dækket med optisk klæbemiddeldæksel, efter at hele brønden var blevet optaget. Denne reaktionsplade blev igen kortvarigt centrifugeret for at centrifugere indholdet ned og sikre, at alle bobler blev elimineret.

Denne blanding blev derefter udsat for en indledende amplifikationscyklus på 50ºC i 2 minutter og 95ºC i 10 minutter, efterfulgt af 45 cykler ved 95ºC i 15 sek. og 60ºC i 1 minut. q-PCR-amplifikationsplottet for hver prøve blev analyseret for at bestemme Ct-værdien. Ct-værdien blev derefter projiceret til standardkurven for referencestammen til kvantificeringen.

Sammenligninger af ændringer i PI, GBI, PPD(%) og PAL (%) både inden for og mellem grupperne blev udført ved hjælp af chi-kvadrattesten. Intragruppesammenligning for middel PPD, middel PAL, middel HbA1c, middel CRP og frekvens af påvisning af P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia og T.forsythia blev vurderet med den parrede prøve t-test, hvorimod intergruppe sammenligninger for de samme variabler blev opnået ved hjælp af en uafhængig prøve t-test.