La malattia parodontale e l'interrelazione del diabete mellito tra i malesi adulti

L'approvazione etica è stata ottenuta sia dal Medical Ethics Boards of University Malaya Medical Center (MEC Ref No: 696.9) sia dal University Malaya Dental Center [DF PE1002/0045(P)]. Centododici pazienti diabetici di tipo 2 (diagnosticati almeno 1 anno prima dello studio) di età compresa tra 30 e 70 anni sono stati sottoposti a screening presso la clinica ambulatoriale per il diabete del Centro medico universitario della Malaya e un totale di 40 pazienti che hanno soddisfatto l'inclusione e l'esclusione criteri sono stati reclutati per lo studio. I pazienti reclutati sono stati poi registrati presso la Clinica di Parodontologia presso la Facoltà di Odontoiatria dell'Università della Malesia. A tutti i pazienti sono stati forniti fogli informativi riguardanti lo studio e spiegazioni verbali. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti reclutati con la consapevolezza che potevano ritirarsi dallo studio in qualsiasi momento. Lo screening e il trattamento dei pazienti sono iniziati da gennaio 2010 a dicembre 2011.

Il calcolo della dimensione del campione ha determinato che 15 soggetti per braccio di trattamento avrebbero fornito l'80% di potenza per rilevare una differenza minima dell'1% (11,0 mmol/mol) di variazione di HbA1c tra il test e il controllo. Di conseguenza, è stato reclutato un campione di 20 soggetti per braccio (40 in totale) per compensare eventuali abbandoni durante il periodo di studio.

Tutti i pazienti sono stati assegnati in modo casuale tramite lancio di una moneta a gruppi NSPT e OHE di pari età. L'investigatore 1 ha selezionato e arruolato i partecipanti e li ha assegnati a gruppi di pari età. L'investigatore 2 ha eseguito la sequenza di assegnazione casuale utilizzando il metodo del lancio della moneta per assegnare i partecipanti ai diversi interventi mentre l'investigatore 1 ha eseguito tutti gli interventi. Non c'era accecamento dei partecipanti o dell'esaminatore.

Poiché nello studio è stato coinvolto un solo esaminatore, è stata eseguita una valutazione dell'affidabilità intra-esaminatore per convalidare la capacità dell'esaminatore di riprodurre costantemente le misurazioni quantitative dei risultati dei parametri clinici utilizzati. Il Plaque Index (PI), il Gingival Bleeding Index (GBI), il Probing Pocket Depth (PPD) e il Probing Attachment Loss (PAL) sono stati misurati nell'intervallo di tempo di circa 3 ore. Utilizzando le statistiche Kappa, sono stati ottenuti buoni accordi (>0,8) per la riproducibilità di tutti i parametri clinici registrati.

Tutti i pazienti reclutati sono stati sottoposti a valutazione parodontale completa al basale, 2 mesi dopo il trattamento assegnato e 3 mesi dopo il trattamento assegnato. L'esame clinico comprendeva l'indice di placca (PI), l'indice di sanguinamento gengivale (GBI), la profondità della tasca al sondaggio (PPD) e la perdita di attaccamento al sondaggio (PAL) misurati con una sonda elettronica a forza costante (Florida Probe®).

Tutti i pazienti sono stati istruiti sui metodi di igiene orale utilizzando uno spazzolino a setole morbide, uno spazzolino a ciuffo compatto, spazzolini interdentali e filo interdentale utilizzando la tecnica di Bass modificata. Lo sbrigliamento completo della bocca, che consisteva in detartrasi e levigatura radicolare, è stato eseguito in un'unica visita per tutti i soggetti del gruppo NSPT utilizzando uno scaler ultrasonico e curette di Gracey. Inoltre, a tutti i pazienti del gruppo NSPT è stato somministrato un collutorio con clorexidina allo 0,12% (Hexipro®). Sono stati istruiti a risciacquare tre volte al giorno usando 15 ml ogni volta per un periodo di 14 giorni iniziando immediatamente dopo il completamento dello sbrigliamento completo della bocca. Successivamente, ad ogni visita di richiamo, tutti i partecipanti sono stati rimotivati ​​e la profilassi professionale è stata eseguita su quelli del gruppo di prova.

15 ml di sangue venoso sono stati raccolti da ciascun paziente al basale, prima del trattamento e 3 mesi dopo i trattamenti assegnati. Sono stati valutati i livelli di emoglobina glicosilata (HbA1c) e di proteina hs-C-reattiva sistemica (hs-CRP). I livelli di hs-CRP sono stati valutati utilizzando test per CRP ad alta sensibilità (hs-CRP). Tutte le analisi del sangue sono state effettuate presso un laboratorio privato (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) senza affiliazione al Dipartimento di Parodontologia. Il test HbA1c è allineato DCCT e l'assicurazione qualità del laboratorio è certificata da Bio-Rad Laboratories (USA), EQAS (External Quality Assurance Services).

Le tasche più profonde sono state identificate (minimo 5 tasche con PPD ≥ 5 mm) e isolate con rulli di cotone. Questa è stata seguita da un'attenta rimozione della placca sopragengivale utilizzando palline di cotone e curette. I campioni di placca sottogengivale sono stati successivamente raccolti utilizzando curette sterili e raggruppati in provette di polietilene sterili prive di DNAsi e RNasi contenenti 1 ml di soluzione tampone fosfato (PBS) e congelate a -80°C fino all'inizio dell'analisi q-PCR.

L'estrazione automatizzata del DNA è stata eseguita in laboratorio utilizzando la macchina QIAcube (Qiagen®). 100 µl di campione di placca sono stati posti in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e sono stati centrifugati a una velocità di 5.000 × g per 10 minuti su una centrifuga da tavolo per ottenere un pellet. I pellet sono stati quindi posizionati sull'agitatore QIAcube per l'estrazione automatizzata del DNA mediante la macchina QIAcube utilizzando il mini kit DNeasy® Blood & Tissue e il set di accessori QIAmp® DNA. Tutti i reagenti forniti nel kit sono stati collocati manualmente nel portabottiglie dei reagenti nella macchina prima dell'inizio del processo. Infine, il protocollo "DNA batterico" è stato selezionato dall'elenco dei protocolli della macchina. In breve, la macchina Qiacube è stata sottoposta a cinque fasi consecutive che includevano i processi di lisi, incubazione, legame, lavaggio ed eluizione. Alla fine del processo erano disponibili 100 µl di DNA eluito. Il DNA estratto è stato quindi testato per la concentrazione e la purezza utilizzando la macchina Nanodrop. Il DNA è stato quindi conservato a -80⁰C prima dell'identificazione batterica utilizzando la macchina q-PCR.

La concentrazione e la purezza del DNA estratto è stata determinata utilizzando la macchina spettrofotometrica (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers) collegata a un software basato su PC. 0,1 µl di DNA eluito sono stati pipettati sul braccio del piedistallo inferiore. Un cavo in fibra ottica (la fibra ricevente) è incorporato all'interno di questo piedistallo. Un secondo cavo in fibra ottica (la fibra sorgente) situato nel braccio del piedistallo superiore viene quindi portato a contatto con il campione di liquido facendo sì che il liquido colmi lo spazio tra le estremità delle due fibre. Una lampada flash allo xeno a impulsi fornisce la sorgente luminosa e uno spettrometro che utilizza un array CCD lineare analizza la luce che passa attraverso il campione. La concentrazione di DNA sia dei campioni di placca che del ceppo di riferimento è stata misurata e registrata di conseguenza. I DNA estratti sono stati infine conservati a -20⁰C fino all'inizio della procedura q-PCR.

Il rilevamento e la quantificazione di P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia e T.forsythia da campioni di placca sono stati effettuati utilizzando Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems che era collegato a un software basato su PC. La quantificazione è stata effettuata proiettando il valore di soglia del ciclo (Ct) dei campioni sulla curva standard della quantità nota (concentrazione) del ceppo batterico di riferimento.

A tale scopo, una quantità nota di DNA estratto dei batteri è stata diluita in serie (diluizione 10 volte) ed è stata sottoposta ad amplificazione RT-PCR. Questo è stato fatto per fornire una curva standard prima dell'amplificazione del DNA da campioni di placca mediante q-PCR. L'ottimizzazione è stata effettuata per ottenere la curva standard ottimale per la quantificazione. Una curva standard finale di diluizione 10 volte dei ceppi di riferimento (intervallo da 10 ng/µl a 0,0001 ng/µl) con un valore R2 di 0,956 è stata utilizzata come base per la quantificazione.

Per determinare la sensibilità della tecnica q-PCR, sono stati elaborati campioni seriali contenenti concentrazioni note di singoli microrganismi per l'analisi q-PCR. La concentrazione più bassa che ha prodotto un prodotto PCR positivo è stata considerata come la sensibilità del test.

L'amplificazione q-PCR è stata eseguita in un volume totale della miscela di reazione di 20 µl. Questa miscela conteneva 2 µl di DNA purificato da campione di placca/ceppo di riferimento per fungere da modello PCR, 10 µl di 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (tampone PCR, dNTP's, Amplitaq Gold, segnale di riferimento, uracil N-glicosilasi, MgCl2; Applied Bio sistemi, Foster City, CA, USA), 1µl Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x) e 7µl di acqua priva di nucleasi. Le procedure sono state condotte utilizzando piastre di reazione a 96 pozzetti.

Tutti i componenti della miscela di reazione (tranne il campione di DNA) sono stati aggiunti a una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. La provetta è stata tappata e vorticata brevemente. Le provette sono state quindi centrifugate per centrifugare il contenuto ed eliminare le bolle d'aria. La miscela è stata quindi trasferita in una piastra di reazione a 96 pozzetti e seguita dall'aggiunta di 2 µl di campione di DNA. La piastra di reazione è stata quindi ricoperta con una copertura adesiva ottica dopo che l'intero pozzetto era stato occupato. Questa piastra di reazione è stata nuovamente centrifugata brevemente per centrifugare il contenuto e per assicurare che tutte le bolle fossero eliminate.

Questa miscela è stata poi sottoposta ad un ciclo iniziale di amplificazione di 50ºC per 2 minuti e 95ºC per 10 minuti, seguito da 45 cicli a 95ºC per 15s e 60ºC per 1 minuto. Il grafico di amplificazione q-PCR per ciascun campione è stato analizzato per determinare il valore Ct. Il valore Ct è stato quindi proiettato sulla curva standard del ceppo di riferimento per la quantificazione.

I confronti dei cambiamenti in PI, GBI, PPD (%) e PAL (%) sia all'interno che tra i gruppi sono stati eseguiti utilizzando il test chi-quadrato. Confronto intragruppo per PPD media, PAL media, HbA1c media, PCR media e frequenza di rilevamento di P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia e T.forsythia sono stati valutati con il t-test del campione accoppiato mentre i confronti tra gruppi per le stesse variabili è stato ottenuto utilizzando un test t campione indipendente.