Vzájemný vztah onemocnění parodontu a diabetu melitus mezi dospělými Malajci

Etické schválení bylo získáno jak od lékařských etických výborů University Malaya Medical Center (MEC Ref No: 696.9) a University Malaya Dental Center [DF PE1002/0045(P)]. Z ambulantní diabetologické kliniky University Malaya Medical Center bylo vyšetřeno 112 pacientů s diabetem 2. typu (diagnostikovaných nejméně 1 rok před studií) ve věku 30 až 70 let a celkem 40 pacientů, kteří splnili zařazení a vyloučení Pro studii byla vybrána kritéria. Rekrutovaní pacienti byli poté registrováni na Parodontologické klinice Fakulty zubního lékařství Malajské univerzity. Všem pacientům byly poskytnuty informační listy pro pacienty týkající se studie a slovní vysvětlení. Od všech přijatých pacientů byl získán informovaný souhlas s tím, že mohou ze studie kdykoli odstoupit. Screening a léčba pacientů byla zahájena od ledna 2010 do prosince 2011.

Výpočet velikosti vzorku určil, že 15 subjektů na léčebné rameno by poskytlo 80% sílu k detekci minimálního rozdílu 1% (11,0 mmol/mol) změny HbA1c mezi testem a kontrolou. V souladu s tím byl vybrán vzorek 20 subjektů na rameno (celkem 40), aby se kompenzovaly možné výpadky během období studie.

Všichni pacienti byli náhodně rozděleni pomocí hodu mincí do věkově odpovídajících skupin NSPT a OHE. Vyšetřovatel 1 prověřil a zapsal účastníky a zařadil je do věkově odpovídajících skupin. Zkoušející 2 provedl sekvenci náhodného přidělování pomocí metody házení mincí, aby přiřadil účastníky k různým intervencím, zatímco vyšetřovatel 1 provedl všechny intervence. Nedošlo k oslepení účastníků ani zkoušejícího.

Vzhledem k tomu, že do studie byl zapojen pouze jeden vyšetřující, bylo provedeno hodnocení spolehlivosti uvnitř vyšetřujícího, aby se ověřila schopnost vyšetřujícího neustále reprodukovat kvantitativní výsledná měření použitých klinických parametrů. V časovém intervalu cca 3 hodin byly měřeny index plaku (PI), index krvácení z dásní (GBI), hloubka sondy (PPD) a ztráta přichycení sondy (PAL). S využitím kappa statistiky byly získány dobré shody (>0,8) pro reprodukovatelnost všech zaznamenaných klinických parametrů.

Všichni vybraní pacienti podstoupili úplné periodontální vyšetření na začátku, 2 měsíce po přidělené léčbě a 3 měsíce po přidělené léčbě. Klinické vyšetření zahrnovalo index plaku (PI), index krvácení z dásní (GBI), hloubku sondy (PPD) a ztrátu přichycení sondy (PAL) měřené elektronickou sondou s konstantní silou (Florida Probe®).

Všichni pacienti byli poučeni o metodách ústní hygieny s použitím měkkého zubního kartáčku, kompaktního zubního kartáčku, mezizubních kartáčků a dentální nitě s využitím modifikované Bassovy techniky. Úplný debridement úst, který sestával ze šupinatění a hoblování kořenů, byl proveden při jediné návštěvě u všech subjektů ve skupině NSPT pomocí ultrazvukového scaleru a Graceyho kyret. Navíc všem pacientům ve skupině NSPT byla podána ústní voda 0,12% chlorhexidin (Hexipro®). Byli instruováni, aby vyplachovali třikrát denně vždy 15 ml po dobu 14 dnů, počínaje ihned po dokončení úplného debridementu úst. Poté při každé svolávací návštěvě byli všichni účastníci znovu motivováni a byla provedena profesionální profylaxe u pacientů v testovací skupině.

Každému pacientovi bylo odebráno 15 ml žilní krve na začátku léčby, před léčbou a 3 měsíce po přidělené léčbě. Byly hodnoceny hladiny glykosylovaného hemoglobinu (HbA1c) a systémového hs-C-reaktivního proteinu (hs-CRP). Hladiny Hs-CRP byly hodnoceny pomocí testů na vysoce senzitivní CRP (hs-CRP). Všechna vyšetření krve byla provedena v soukromé laboratoři (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) bez příslušnosti k oddělení parodontologie. Testování HbA1c je v souladu s DCCT a zajištění kvality laboratoře je certifikováno pod Bio-Rad Laboratories (USA), EQAS (External Quality Assurance Services).

Byly identifikovány nejhlubší kapsy (minimálně 5 kapes s PPD ≥ 5 mm) a izolovány bavlněnými smotky. Následovalo pečlivé odstranění supragingiválního plaku pomocí vatových pelet a kyret. Vzorky subgingiválního plaku byly následně odebrány za použití sterilních kyret a spojeny do sterilní polyethylenové zkumavky bez DNázy a RNázy obsahující 1 ml roztoku fosfátového pufru (PBS) a zmrazené při -80 °C až do zahájení analýzy q-PCR.

Automatická extrakce DNA byla provedena v laboratoři pomocí přístroje QIAcube (Qiagen®). 100 ul vzorku plaku bylo umístěno do 1,5 ml centrifugační zkumavky a bylo centrifugováno při rychlosti 5000 x g po dobu 10 minut na stolním odstředivce, aby se získala peleta. Pelety byly poté umístěny na třepačku QIAcube pro automatickou extrakci DNA pomocí zařízení QIAcube s použitím sady DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit a sady příslušenství QIAmp® DNA. Všechna činidla obsažená v soupravě byla ručně umístěna do stojanu na láhve s činidly ve stroji před zahájením procesu. Nakonec byl ze seznamu protokolů přístroje vybrán protokol "Bakteriální DNA". Stručně řečeno, stroj Qiacube prošel pěti po sobě jdoucími kroky, které zahrnovaly lýzu, inkubaci, vazbu, promývání a eluci. Na konci procesu bylo k dispozici 100 ul eluované DNA. Extrahovaná DNA byla poté testována na koncentraci a čistotu pomocí přístroje Nanodrop. DNA byla poté uložena při -80 °C před bakteriální identifikací pomocí přístroje q-PCR.

Koncentrace a čistota extrahované DNA byla stanovena pomocí spektrofotometru (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers), který byl propojen se softwarem na bázi PC. 0,1 ul eluované DNA bylo napipetováno na spodní rameno podstavce. V tomto podstavci je zabudován optický kabel (přijímací vlákno). Druhý kabel z optických vláken (zdrojové vlákno) umístěný v horním podstavcovém rameni se pak přivede do kontaktu s kapalným vzorkem, čímž kapalina přemostí mezeru mezi konci dvou vláken. Pulzní xenonová záblesková lampa poskytuje zdroj světla a spektrometr využívající lineární CCD pole analyzuje světlo procházející vzorkem. Koncentrace DNA ze vzorků plaků a referenčního kmene byla měřena a podle toho zaznamenána. Extrahované DNA byly nakonec skladovány při -20 °C až do zahájení procedury q-PCR.

Detekce a kvantifikace P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia a T.forsythia ze vzorků plaků byla provedena pomocí Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems, který byl připojen k PC softwaru. Kvantifikace byla provedena projekcí prahové hodnoty cyklu (Ct) vzorků na standardní křivku známého množství (koncentrace) bakteriálního referenčního kmene.

Pro tento účel bylo známé množství extrahované DNA bakterií sériově zředěno (10násobné ředění) a podrobeno RT-PCR amplifikaci. To bylo provedeno za účelem poskytnutí standardní křivky před amplifikací DNA ze vzorků plaků pomocí q-PCR. Optimalizace byla provedena za účelem získání optimální standardní křivky pro kvantifikaci. Jako základ pro kvantifikaci byla použita finální 10násobná standardní křivka ředění referenčních kmenů (rozsah od 10 ng/ul-0,0001 ng/ul) s hodnotou R2 0,956.

Pro stanovení citlivosti techniky q-PCR byly sériové vzorky obsahující známé koncentrace jednotlivých mikroorganismů zpracovány pro analýzu q-PCR. Nejnižší koncentrace, která vedla k pozitivnímu produktu PCR, byla považována za citlivost testu.

Amplifikace q-PCR byla provedena v celkovém objemu reakční směsi 20 ul. Tato směs obsahovala 2 µl purifikované DNA ze vzorku plaku/referenčního kmene, který působil jako PCR templát, 10 µl 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (PCR pufr, dNTP, Amplitaq Gold, referenční signál, uracil N-glykosyláza, MgCl2; Applied Bio systémy, Foster City, CA, USA), 1 ul Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x) a 7 ul vody bez nukleázy. Postupy byly prováděny s použitím 96-jamkových reakčních destiček.

Všechny složky reakční směsi (kromě vzorku DNA) byly přidány do 1,5ml mikrocentrifugační zkumavky. Zkumavka byla uzavřena a krátce promíchána na vortexu. Zkumavky byly poté odstředěny, aby se obsah odstředil a odstranily se vzduchové bubliny. Směs byla poté přenesena na 96jamkovou reakční destičku a následovalo přidání 2 ul vzorku DNA. Reakční deska byla poté pokryta optickým adhezivním krytem poté, co byla obsazena celá jamka. Tato reakční destička byla znovu krátce odstředěna, aby se obsah odstředil a aby se zajistilo odstranění všech bublin.

Tato směs byla poté podrobena počátečnímu amplifikačnímu cyklu 50 °C po dobu 2 minut a 95 °C po dobu 10 minut, poté následovalo 45 cyklů při 95 °C po dobu 15 sekund a 60 °C po dobu 1 minuty. Graf amplifikace q-PCR pro každý vzorek byl analyzován za účelem stanovení hodnoty Ct. Hodnota Ct byla poté promítnuta do standardní křivky referenčního kmene pro kvantifikaci.

Srovnání změn v PI, GBI, PPD (%) a PAL (%) jak v rámci skupin, tak mezi nimi bylo provedeno pomocí chí-kvadrát testu. Vnitroskupinové srovnání průměrného PPD, průměrného PAL, průměrného HbA1c, průměrného CRP a frekvence detekce P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia a T.forsythia bylo hodnoceno pomocí párového vzorkového t-testu, zatímco meziskupinová srovnání pro stejné proměnné byla provedena pomocí nezávislého vzorku t-testu.