Parodontala sjukdomar och diabetes mellitus samspel bland vuxna malaysier

Etiskt godkännande erhölls från både Medical Ethics Boards of University Malaya Medical Center (MEC Ref No: 696.9) och University Malaya Dental Center [DF PE1002/0045(P)]. Hundra och tolv typ 2-diabetespatienter (diagnostiserade minst 1 år före studien) mellan 30 och 70 år screenades från diabeteskliniken vid University Malaya Medical Center och totalt 40 patienter som uppfyllde inkluderingen och exkluderingen kriterier rekryterades för studien. De rekryterade patienterna registrerades sedan vid parodontologiska kliniken vid odontologiska fakulteten, University of Malaya. Patientinformationsblad angående studien och muntliga förklaringar gavs till alla patienter. Informerat samtycke erhölls från alla rekryterade patienter med förutsättningen att de kunde dra sig ur studien när som helst. Screening och behandling av patienter påbörjades från januari 2010 till december 2011.

Provstorleksberäkningen fastställde att 15 försökspersoner per behandlingsarm skulle ge 80 % kraft för att detektera en minsta skillnad på 1 % (11,0 mmol/mol) förändring i HbA1c mellan test och kontroll. Följaktligen rekryterades ett urval av 20 försökspersoner per arm (40 totalt) för att kompensera för eventuella avhopp under studieperioden.

Alla patienter tilldelades slumpmässigt via en myntkastning till åldersmatchade NSPT- och OHE-grupper. Utredare 1 screenade och registrerade deltagare och tilldelade dem till åldersmatchade grupper. Utredare 2 utförde den slumpmässiga tilldelningssekvensen med hjälp av myntkastningsmetoden för att tilldela deltagare de olika interventionerna medan utredare 1 utförde all intervention. Det fanns ingen blindning av deltagare eller examinator.

Eftersom endast en granskare var inblandad i studien, utfördes intra-examinatorns tillförlitlighetsbedömning för att validera granskarens förmåga att ständigt reproducera de kvantitativa utfallsmätningarna av de använda kliniska parametrarna. Plackindex (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) och Probing Attachment Loss (PAL) mättes i tidsintervallet cirka 3 timmar. Genom att använda Kappa-statistik erhölls goda överensstämmelser (>0,8) för reproducerbarhet av alla registrerade kliniska parametrar.

Alla rekryterade patienter genomgick fullständig periodontal bedömning vid baslinjen, 2 månader efter tilldelad behandling och 3 månader efter tilldelad behandling. Den kliniska undersökningen inkluderade Plack Index (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) och Probing Attachment Loss (PAL) mätt med en elektronisk konstantkraftsond (Florida Probe®).

Alla patienter instruerades i munhygienmetoder med hjälp av en tandborste med mjuk borst, en tandborste med kompakt tofs, interdentala borstar och tandtråd med den modifierade bastekniken. Debridering av hel mun, som bestod av fjällning och rothyvling, gjordes i ett enda besök för alla försökspersoner i NSPT-gruppen med hjälp av en ultraljudsskalare och Gracey-kyretter. Dessutom fick alla patienter i NSPT-gruppen en 0,12 % klorhexidin-munsköljning (Hexipro®). De instruerades att skölja tre gånger om dagen med 15 ml varje gång under en period av 14 dagar med början omedelbart efter fullföljande av debridering i munnen. Därefter vid varje återkallelsebesök motiverades alla deltagare på nytt och professionell profylax utfördes på dem i testgruppen.

15 ml venöst blod samlades in från varje patient vid baslinjen, före behandling och 3 månader efter tilldelade behandlingar. Nivåer av glykosylerat hemoglobin (HbA1c) och systemiskt hs-C-reaktivt protein (hs-CRP) utvärderades. Hs-CRP-nivåer bedömdes med hjälp av tester för högkänslig CRP (hs-CRP). Alla blodundersökningar gjordes på ett privat laboratorium (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) utan anknytning till Institutionen för parodontologi. HbA1c-testningen är DCCT-anpassad och laboratoriets kvalitetssäkring är certifierad enligt Bio-Rad Laboratories (USA), EQAS (External Quality Assurance Services).

De djupaste fickorna identifierades (minst 5 fickor med PPD ≥ 5 mm) och isolerades med bomullsrullar. Detta följdes av försiktigt avlägsnande av supragingival plack med hjälp av bomullspellets och kyretter. Subgingivala plackprover samlades därefter in med hjälp av sterila kyretter och slogs samman i sterila DNAs-fria och RNas-fria polyetenrör innehållande 1 ml fosfatbuffertlösning (PBS) och frystes vid -800°C tills q-PCR-analys påbörjades.

Automatiserad DNA-extraktion utfördes i labbet med hjälp av QIAcube-maskinen (Qiagen®). 100 µl plackprov placerades i ett 1,5 ml centrifugrör och centrifugerades vid en hastighet av 5 000 x g under 10 minuter på en bordscentrifug för att erhålla en pellet. Pelletarna placerades sedan på QIAcube-shakern för automatisk DNA-extraktion med QIAcube-maskin med användning av DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit och QIAmp® DNA-tillbehörsset. Alla reagenser som ingår i satsen placerades manuellt i reagensflaskstället i maskinen innan processen startade. Slutligen valdes protokollet "Bakteriellt DNA" från maskinens protokolllista. Kortfattat genomgick Qiacube-maskinen fem på varandra följande steg som inkluderade lyserings-, inkuberings-, bindnings-, tvätt- och elueringsprocesser. Vid slutet av processen var 100 ul eluerat DNA tillgängligt. Det extraherade DNA:t testades sedan för koncentration och renhet med hjälp av Nanodrop-maskin. DNA:t lagrades sedan i -80°C före bakteriell identifiering med användning av q-PCR-maskin.

Koncentrationen och renheten av extraherat DNA bestämdes med användning av spektrofotometermaskinen (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers) som var kopplad till en PC-baserad programvara. 0,1 ul eluerat DNA pipetterades på den nedre piedestalarmen. En fiberoptisk kabel (den mottagande fibern) är inbäddad i denna piedestal. En andra fiberoptisk kabel (källfibern) placerad i den övre piedestalarmen bringas sedan i kontakt med vätskeprovet vilket får vätskan att överbrygga gapet mellan ändarna av de två fibrerna. En pulsad xenonblixtlampa tillhandahåller ljuskällan och en spektrometer som använder en linjär CCD-matris analyserar ljuset som passerar genom provet. DNA-koncentrationen från både plackprover och referensstam mättes och registrerades i enlighet med detta. De extraherade DNA:n lagrades slutligen i -20°C tills början av q-PCR-proceduren.

Detekteringen och kvantifieringen av P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia och T.forsythia från plackprover gjordes med hjälp av Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems som var kopplat till PC-baserad programvara. Kvantifieringen gjordes genom att projicera cykeltröskelvärdet (Ct) för proverna på standardkurvan för den kända mängden (koncentrationen) av bakteriereferensstam.

För detta ändamål serieutspäddes en känd mängd extraherat DNA från bakterierna (10-faldig spädning) och utsattes för RT-PCR-amplifiering. Detta gjordes för att tillhandahålla en standardkurva före amplifiering av DNA från plackprover med användning av q-PCR. Optimering genomfördes för att få den optimala standardkurvan för kvantifiering. En slutlig 10-faldig utspädningsstandardkurva för referensstammar (intervall från 10 ng/µl-0,0001 ng/µl) med R2-värde på 0,956 användes som bas för kvantifiering.

För att bestämma känsligheten hos q-PCR-tekniken bearbetades serieprover innehållande kända koncentrationer av individuella mikroorganismer för q-PCR-analys. Den lägsta koncentrationen som resulterade i en positiv PCR-produkt ansågs vara analysens känslighet.

q-PCR-amplifiering gjordes i en total reaktionsblandningsvolym av 20 ul. Denna blandning innehöll 2 µl renat DNA från plackprov/referensstam för att fungera som PCR-mall, 10 µl 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (PCR-buffert, dNTP:er, Amplitaq Gold, referenssignal, uracil N-glykosylas, MgCl2; Applied Bio system, Foster City, CA, USA), 1 µl Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x) och 7 µl nukleasfritt vatten. Förfarandena utfördes med användning av 96-brunnars reaktionsplattor.

Alla komponenterna i reaktionsblandningen (förutom DNA-prov) sattes till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Röret förslöts och vortexades kort. Rören centrifugerades sedan för att snurra ner innehållet och eliminera luftbubblor. Blandningen överfördes sedan till en reaktionsplatta med 96 brunnar och följdes av tillsats av 2 ul DNA-prov. Reaktionsplattan täcktes sedan med optiskt bindemedelshölje efter att hela brunnen hade varit upptagen. Denna reaktionsplatta centrifugerades återigen kort för att snurra ner innehållet och för att säkerställa att alla bubblor eliminerades.

Denna blandning utsattes sedan för en initial amplifieringscykel på 50ºC i 2 minuter och 95ºC i 10 minuter, följt av 45 cykler vid 95ºC i 15 s och 60ºC i 1 minut. q-PCR-amplifieringsdiagrammet för varje prov analyserades för att bestämma Ct-värdet. Ct-värdet projicerades sedan till standardkurvan för referensstammen för kvantifieringen.

Jämförelser av förändringar i PI, GBI, PPD(%) och PAL (%) både inom och mellan grupperna utfördes med hjälp av chi-kvadrattestet. Intragruppsjämförelse för medel-PPD, medel-PAL, medelvärde HbA1c, medel-CRP och frekvens för detektion av P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia och T.forsythia bedömdes med det parade provets t-test medan jämförelser mellan grupper för samma variabler utfördes med användning av ett oberoende prov t-test.