成人マレーシア人の歯周病と糖尿病の相互関係

倫理的承認は、マラヤ大学医療センター (MEC 参照番号: 696.9) とマラヤ大学歯科センター [DF PE1002/0045(P)] の両方の医療倫理委員会から得られました。 30歳から70歳までの112人の2型糖尿病患者（研究の少なくとも1年前に診断された）がマラヤ大学医療センターの外来糖尿病クリニックからスクリーニングを受け、合計40人の患者が包含および除外を満たした。研究のために採用された基準。 その後、募集された患者はマラヤ大学歯学部の歯周病クリニックに登録されました。 研究に関する患者情報シートと口頭説明がすべての患者に与えられた。 採用された患者全員から、いつでも研究から撤退できることを理解した上でインフォームドコンセントを得た。 患者のスクリーニングと治療は、2010 年 1 月から 2011 年 12 月まで開始されました。

サンプルサイズの計算により、各治療群あたり 15 人の被験者は、テストとコントロールの間の HbA1c 変化の最小 1% (11.0 mmol/mol) の差を検出するのに 80% の検出力を提供すると決定されました。 したがって、研究期間中の脱落の可能性を補うために、各アームあたり 20 人の被験者 (合計 40 人) のサンプルが採用されました。

すべての患者は、年齢が一致する NSPT グループと OE グループにコイントスによってランダムに割り当てられました。 研究者 1 は参加者をスクリーニングして登録し、年齢が一致するグループに割り当てました。 研究者 2 はコイントス法を使用してランダム割り当てシーケンスを実行し、参加者をさまざまな介入に割り当てました。一方、研究者 1 はすべての介入を実行しました。 参加者や試験官を盲目にすることはありませんでした。

この研究には 1 人の検査官のみが関与したため、使用された臨床パラメータの定量的結果測定を常に再現する検査官の能力を検証するために、検査官内信頼性評価が実行されました。 プラーク指数（PI）、歯肉出血指数（GBI）、ポケット深さのプロービング（PPD）、および付着損失のプロービング（PAL）を約 3 時間の間隔で測定しました。 カッパ統計を利用すると、記録されたすべての臨床パラメーターの再現性について良好な一致 (>0.8) が得られました。

採用されたすべての患者は、ベースライン、割り当てられた治療の 2 か月後、および割り当てられた治療の 3 か月後に完全な歯周評価を受けました。 臨床検査には、プラーク指数（PI）、歯肉出血指数（GBI）、プロービングポケット深さ（PPD）、電子コンスタントフォースプローブ（Florida Probe®）で測定したプロービングアタッチメントロス（PAL）が含まれていました。

すべての患者は、修正バス技術を利用した柔らかい毛の歯ブラシ、コンパクトタフト歯ブラシ、歯間ブラシ、デンタルフロスを使用した口腔衛生方法を指導されました。 スケーリングとルートプレーニングからなる口全体のデブリードマンは、超音波スケーラーとグレイシーキュレットを使用して、NSPTグループのすべての被験者に対して1回の来院で行われました。 さらに、NSPT グループのすべての患者には 0.12% クロルヘキシジン洗口剤 (Hexipro®) が与えられました。 彼らは、口全体の創傷面切除術の完了直後から開始して 14 日間、1 日 3 回、毎回 15ml を使用してすすぐように指示されました。 その後、リコール訪問のたびに、参加者全員が再びやる気を取り戻し、テストグループの参加者に対して専門的な予防措置が実施されました。

ベースライン時、治療前、および割り当てられた治療の 3 か月後に、各患者から 15 ml の静脈血を採取しました。 グリコシル化ヘモグロビン (HbA1c) および全身性 hs-C 反応性タンパク質 (hs-CRP) のレベルを評価しました。 Hs-CRP レベルは、高感度 CRP (hs-CRP) の検査を使用して評価されました。 すべての血液検査は民間研究所 (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) は歯周病科とは無関係です。 HbA1c 検査は DCCT に準拠しており、検査室の品質保証は Bio-Rad Laboratories (米国)、EQAS (外部品質保証サービス) に基づいて認定されています。

最も深いポケットを特定し（PPD ≥ 5 mm の最小 5 つのポケット）、綿のロールで隔離しました。 続いて、綿ペレットとキュレットを使用して歯肉縁上のプラークを注意深く除去しました。 続いて、滅菌キュレットを使用して歯肉縁下プラークサンプルを収集し、1mlのリン酸緩衝液（PBS）を含む滅菌DNAseフリーおよびRNaseフリーのポリエチレンチューブにプールし、q-PCR分析の開始まで-80℃で凍結した。

自動化された DNA 抽出は、QIAcube マシン (Qiagen®) を使用して研究室で実行されました。 100μlのプラークサンプルを1.5ml遠心管に入れ、卓上遠心機にて5,000×gの速度で10分間遠心分離してペレットを得た。 次にペレットを QIAcube シェーカー上に置き、DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit および QIAmp® DNA 付属品セットを使用した QIAcube マシンによる自動 DNA 抽出を行いました。 キットに含まれるすべての試薬は、プロセスの開始前に機械の試薬ボトル ラックに手動で配置されました。 最後に、マシンのプロトコル リストから「Bacterial DNA」プロトコルが選択されました。 簡単に説明すると、Qiacube マシンは、溶解、インキュベート、結合、洗浄、および溶出プロセスを含む 5 つの連続したステップを実行しました。 プロセスの最後には、100μl の溶出 DNA が得られました。 抽出された DNA は、Nanodrop マシンを使用して濃度と純度がテストされました。 その後、q-PCR 装置を使用して細菌を同定する前に、DNA を -80℃ で保存しました。

抽出された DNA の濃度と純度は、PC ベースのソフトウェアに接続された分光光度計機 (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 分光光度計) を使用して測定されました。 溶出した DNA 0.1 μl を下部台座アームにピペットで移しました。 光ファイバーケーブル (受信ファイバー) がこの台座内に埋め込まれています。 次に、上部台座アームにある 2 番目の光ファイバー ケーブル (ソース ファイバー) が液体サンプルと接触し、液体が 2 本のファイバーの端の間のギャップを橋渡しします。 パルスキセノンフラッシュランプが光源となり、リニア CCD アレイを利用した分光計がサンプルを通過する光を分析します。 プラークサンプルと参照株の両方からの DNA 濃度を測定し、それに応じて記録しました。 抽出された DNA は、最終的に q-PCR 手順の開始まで -20℃ で保存されました。

プラークサンプルからの P. ジンジバリス、A. アクチノミセテムコミタンス、P. インターメディア、および T. レンギョウの検出と定量は、PC ベースのソフトウェアに接続された Applied Biosystems® 7500 リアルタイム PCR システムを使用して行われました。 定量化は、サンプルのサイクル閾値 (Ct) 値を細菌参照株の既知の量 (濃度) の標準曲線に投影することによって行われました。

この目的のために、既知量の細菌の抽出 DNA を段階希釈し (10 倍希釈)、RT-PCR 増幅に供しました。 これは、q-PCR を使用してプラークサンプルから DNA を増幅する前に標準曲線を提供するために行われました。 定量化に最適な標準曲線を得るために最適化を実施しました。 R2 値が 0.956 の参照株の最終 10 倍希釈標準曲線 (10 ng/μl ～ 0.0001 ng/μl の範囲) を定量のベースとして使用しました。

q-PCR 技術の感度を決定するために、既知濃度の個々の微生物を含む連続サンプルを q-PCR 分析用に処理しました。 陽性の PCR 産物をもたらした最低濃度をアッセイの感度とみなしました。

q-PCR 増幅は、反応混合物の総量 20 μl で行いました。 この混合物には、PCR テンプレートとして機能するプラーク サンプル/参照株からの精製 DNA 2 μl、2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (PCR バッファー、dNTP、Amplitaq Gold、参照シグナル、ウラシル N-グリコシラーゼ、MgCl2、Applied Bio) 10 μl が含まれていました。システム、米国カリフォルニア州フォスターシティ）、1µl Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x)、および 7µl ヌクレアーゼフリー水。 この手順は 96 ウェル反応プレートを使用して行われました。

反応混合物のすべての成分 (DNA サンプルを除く) を 1.5 mL 微量遠心分離管に加えました。 チューブに蓋をし、軽くボルテックスした。 次いで、チューブを遠心分離して内容物をスピンダウンし、気泡を除去した。 次いで、混合物を96ウェル反応プレートに移し、続いて2μlのDNAサンプルを添加した。 次いで、ウェル全体が埋まった後、反応プレートを光学接着カバーで覆った。 この反応プレートを再び短時間遠心分離して内容物をスピンダウンし、すべての気泡を確実に除去した。

次に、この混合物を 50℃で 2 分間、95℃で 10 分間の初期増幅サイクルに供し、続いて 95℃で 15 秒間、および 60℃で 1 分間を 45 サイクル行いました。 各サンプルの q-PCR 増幅プロットを分析して、Ct 値を決定しました。 次に、定量化のために Ct 値を参照ひずみの標準曲線に投影しました。

グループ内およびグループ間のPI、GBI、PPD(%)、およびPAL(%)の変化の比較は、カイ二乗検定を使用して実行されました。 平均PPD、平均PAL、平均HbA1c、平均CRP、およびP.ジンジバリス、A.アクチノマイセテムコミタンス、P.インターメディア、およびT.レンギョウの検出頻度に関するグループ内比較は、対応のあるサンプルのt検定で評価されましたが、同じ変数のグループ間比較は、独立したサンプルの t 検定を使用して達成されました。