Взаимосвязь заболеваний пародонта и сахарного диабета среди взрослых жителей Малайзии

Этическое одобрение было получено как от Совета по медицинской этике Медицинского центра Университета Малайя (номер MEC: 696.9), так и от Стоматологического центра Университета Малайя [DF PE1002/0045(P)]. Сто двенадцать пациентов с диабетом 2-го типа (диагностированных не менее чем за 1 год до исследования) в возрасте от 30 до 70 лет были обследованы в амбулаторной диабетической клинике Медицинского центра Университета Малая. критерии были набраны для исследования. Затем набранные пациенты были зарегистрированы в пародонтологической клинике стоматологического факультета Малайского университета. Всем пациентам были выданы информационные листы для пациентов, касающиеся исследования, и устные пояснения. Информированное согласие было получено от всех набранных пациентов с пониманием того, что они могут выйти из исследования в любое время. Обследование и лечение пациентов началось с января 2010 года по декабрь 2011 года.

Расчет размера выборки определил, что 15 субъектов в группе лечения обеспечат 80% мощности для обнаружения минимальной разницы в 1% (11,0 ммоль/моль) изменения HbA1c между тестом и контролем. Соответственно, была набрана выборка из 20 субъектов на группу (всего 40), чтобы компенсировать возможное отсев в течение периода исследования.

Все пациенты были случайным образом распределены путем подбрасывания монеты в соответствующие по возрасту группы NSPT и OHE. Исследователь 1 проверил и зарегистрировал участников и распределил их по возрастным группам. Исследователь 2 выполнил последовательность случайного распределения, используя метод подбрасывания монеты, чтобы распределить участников по разным вмешательствам, в то время как Исследователь 1 выполнил все вмешательства. Не было ослепления участников или экзаменатора.

Поскольку в исследовании участвовал только один исследователь, была проведена оценка надежности внутри исследователя, чтобы подтвердить способность исследователя постоянно воспроизводить количественные результаты измерения используемых клинических параметров. Индекс зубного налета (PI), индекс кровоточивости десен (GBI), глубина кармана при зондировании (PPD) и потеря прикрепления при зондировании (PAL) измерялись во временном интервале около 3 часов. Используя статистику Каппа, были получены хорошие совпадения (>0,8) для воспроизводимости всех зарегистрированных клинических параметров.

Все набранные пациенты прошли полную оценку состояния пародонта исходно, через 2 месяца после назначенного лечения и через 3 месяца после назначенного лечения. Клиническое обследование включало индекс зубного налета (PI), индекс кровоточивости десен (GBI), глубину кармана при зондировании (PPD) и потерю прикрепления при зондировании (PAL), измеренные с помощью электронного датчика постоянной силы (Florida Probe®).

Всех пациентов обучали методам гигиены полости рта с использованием зубной щетки с мягкой щетиной, зубной щетки с компактным пучком, межзубных ершиков и зубной нити по модифицированной методике Басса. Полная санация полости рта, которая состояла из скейлинга и полировки корней, была проведена за одно посещение для всех пациентов в группе NSPT с использованием ультразвукового скейлера и кюрет Gracey. Кроме того, все пациенты в группе NSPT получали ополаскиватель для полости рта с содержанием 0,12% хлоргексидина (Hexipro®). Они были проинструктированы полоскать рот три раза в день, используя 15 мл каждый раз в течение 14 дней, начиная сразу после завершения полной обработки полости рта. После этого при каждом повторном посещении всех участников повторно мотивировали, и участникам тестовой группы проводилась профессиональная профилактика.

У каждого пациента исходно, до лечения и через 3 месяца после назначенного лечения было взято по 15 мл венозной крови. Оценивали уровни гликозилированного гемоглобина (HbA1c) и системного hs-C-реактивного белка (hs-CRP). Уровни вч-СРБ оценивали с помощью тестов на высокочувствительный СРБ (вч-СРБ). Все исследования крови проводились в частной лаборатории (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) без принадлежности к кафедре пародонтологии. Анализ HbA1c соответствует стандарту DCCT, а служба обеспечения качества лаборатории сертифицирована Bio-Rad Laboratories (США), EQAS (Внешние службы обеспечения качества).

Выявляли самые глубокие карманы (минимум 5 карманов с PPD ≥ 5 мм) и изолировали ватными валиками. За этим последовало осторожное удаление наддесневого налета с помощью ватных тампонов и кюреток. Затем образцы поддесневого зубного налета собирали с помощью стерильных кюреток и помещали в стерильную полиэтиленовую пробирку, не содержащую ДНКазы и РНКазы, содержащую 1 мл раствора фосфатного буфера (PBS), и замораживали при -80°C до начала анализа количественной ПЦР.

Автоматическую экстракцию ДНК проводили в лаборатории с использованием машины QIAcube (Qiagen®). 100 мкл образца зубного налета помещали в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали при скорости 5000×g в течение 10 минут на настольной центрифуге для получения осадка. Затем осадки помещали в шейкер QIAcube для автоматической экстракции ДНК с помощью машины QIAcube с использованием мини-набора DNeasy® Blood & Tissue и набора принадлежностей QIAmp® DNA. Все реагенты, входящие в набор, были вручную помещены в штатив для бутылей с реагентами в машине до начала процесса. Наконец, протокол «Бактериальная ДНК» был выбран из списка протоколов машины. Вкратце, машина Qiacube прошла пять последовательных этапов, включая процессы лизиса, инкубации, связывания, промывки и элюирования. В конце процесса было доступно 100 мкл элюированной ДНК. Затем экстрагированную ДНК тестировали на концентрацию и чистоту с использованием машины Nanodrop. Затем ДНК хранили при температуре -80⁰C перед идентификацией бактерий с использованием машины для количественной ПЦР.

Концентрацию и чистоту экстрагированной ДНК определяли с использованием спектрофотометра (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers), который был связан с программным обеспечением на базе ПК. 0,1 мкл элюированной ДНК пипеткой наносили на нижний рычаг подставки. Волоконно-оптический кабель (приемное волокно) встроен в этот пьедестал. Затем второй оптоволоконный кабель (исходное волокно), расположенный в верхнем кронштейне опоры, приводится в контакт с жидким образцом, в результате чего жидкость перекрывает зазор между концами двух волокон. Импульсная ксеноновая импульсная лампа служит источником света, а спектрометр, использующий линейную ПЗС-матрицу, анализирует свет, проходящий через образец. Концентрацию ДНК как в образцах бляшек, так и в эталонном штамме измеряли и записывали соответствующим образом. Экстрагированные ДНК в конечном итоге хранили при температуре -20⁰C до начала процедуры количественной ПЦР.

Обнаружение и количественный анализ P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia и T.forsythia в образцах зубного налета проводили с использованием систем ПЦР в реальном времени Applied Biosystems® 7500, которые были подключены к программному обеспечению на базе ПК. Количественную оценку проводили путем проецирования значения порога цикла (Ct) образцов на стандартную кривую известного количества (концентрации) эталонного штамма бактерий.

Для этого известное количество выделенной ДНК бактерий серийно разбавляли (10-кратное разведение) и подвергали амплификации ОТ-ПЦР. Это было сделано для получения стандартной кривой до амплификации ДНК из образцов бляшек с использованием количественной ПЦР. Оптимизацию проводили для того, чтобы получить оптимальную стандартную кривую для количественного определения. Окончательная стандартная кривая 10-кратного разведения эталонных штаммов (диапазон от 10 нг/мкл до 0,0001 нг/мкл) со значением R2 0,956 использовалась в качестве основы для количественного определения.

Чтобы определить чувствительность метода количественной ПЦР, серийные образцы, содержащие известные концентрации отдельных микроорганизмов, были обработаны для анализа количественной ПЦР. Самая низкая концентрация, которая приводила к положительному продукту ПЦР, считалась чувствительностью анализа.

Амплификацию q-PCR проводили в общем объеме реакционной смеси 20 мкл. Эта смесь содержала 2 мкл очищенной ДНК образца зубного налета/эталонный штамм для использования в качестве ПЦР-матрицы, 10 мкл 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (ПЦР-буфер, dNTP, Amplitaq Gold, эталонный сигнал, урацил-N-гликозилаза, MgCl2; Applied Bio системы, Фостер-Сити, Калифорния, США), 1 мкл Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x) и 7 мкл воды, не содержащей нуклеаз. Процедуры проводились с использованием 96-луночных реакционных планшетов.

Все компоненты реакционной смеси (кроме образца ДНК) добавляли в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Пробирку закрывали крышкой и кратко встряхивали. Затем пробирки центрифугировали для центрифугирования содержимого и удаления пузырьков воздуха. Затем смесь переносили в 96-луночный реакционный планшет с последующим добавлением 2 мкл образца ДНК. Затем реакционный планшет покрывали оптическим клейким покрытием после того, как вся лунка была заполнена. Эту реакционную пластину снова кратко центрифугировали, чтобы центрифугировать содержимое и убедиться, что все пузырьки удалены.

Затем эту смесь подвергали начальному циклу амплификации при 50°С в течение 2 минут и при 95°С в течение 10 минут, после чего следовали 45 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 минуты. График амплификации q-PCR для каждого образца анализировали для определения значения Ct. Затем значение Ct проецировали на стандартную кривую эталонного штамма для количественного определения.

Сравнение изменений PI, GBI, PPD(%) и PAL(%) как внутри групп, так и между группами проводили с использованием критерия хи-квадрат. Внутригрупповое сравнение среднего PPD, среднего PAL, среднего HbA1c, среднего CRP и частоты обнаружения P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia и T.forsythia оценивали с помощью парного выборочного t-критерия, тогда как межгрупповые сравнения для тех же переменных было выполнено с использованием независимого выборочного t-критерия.