A inter-relação entre doença periodontal e diabetes mellitus entre malaios adultos

A aprovação ética foi obtida dos Conselhos de Ética Médica do University Malaya Medical Center (MEC Ref No: 696.9) e do University Malaya Dental Center [DF PE1002/0045(P)]. Cento e doze pacientes diabéticos tipo 2 (diagnosticados pelo menos 1 ano antes do estudo) com idades entre 30 e 70 anos foram rastreados na Clínica de Diabetes ambulatorial do University Malaya Medical Center e um total de 40 pacientes que preencheram os critérios de inclusão e exclusão critérios foram recrutados para o estudo. Os pacientes recrutados foram registrados na Clínica de Periodontologia da Faculdade de Odontologia da Universidade da Malásia. Folhas de informações do paciente sobre o estudo e explicações verbais foram dadas a todos os pacientes. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes recrutados com o entendimento de que eles poderiam se retirar do estudo a qualquer momento. A triagem e o tratamento dos pacientes começaram de janeiro de 2010 a dezembro de 2011.

O cálculo do tamanho da amostra determinou que 15 indivíduos por braço de tratamento forneceriam 80% de poder para detectar uma diferença mínima de 1% (11,0 mmol/mol) de alteração na HbA1c entre o teste e o controle. Assim, uma amostra de 20 indivíduos por braço (40 no total) foi recrutada para compensar possíveis desistências durante o período do estudo.

Todos os pacientes foram designados aleatoriamente por sorteio para os grupos NSPT e OHE pareados por idade. O investigador 1 rastreou e inscreveu os participantes e os designou para grupos de mesma idade. O investigador 2 realizou a sequência de alocação aleatória usando o método de sorteio para atribuir participantes às diferentes intervenções, enquanto o investigador 1 realizou todas as intervenções. Não houve cegamento dos participantes ou do examinador.

Como apenas um examinador estava envolvido no estudo, a avaliação da confiabilidade intra-examinador foi realizada para validar a capacidade do examinador de reproduzir constantemente as medidas quantitativas dos resultados dos parâmetros clínicos usados. O Índice de Placa (PI), Índice de Sangramento Gengival (GBI), Profundidade da Bolsa de Sondagem (PPD) e Perda de Inserção de Sondagem (PAL) foram medidos no intervalo de tempo de cerca de 3 horas. Utilizando estatísticas Kappa, bons acordos (>0,8) foram obtidos para a reprodutibilidade de todos os parâmetros clínicos registrados.

Todos os pacientes recrutados foram submetidos a avaliação periodontal completa no início do estudo, 2 meses após o tratamento designado e 3 meses após o tratamento designado. O exame clínico incluiu Índice de Placa (PI), Índice de Sangramento Gengival (GBI), Profundidade da Bolsa de Sondagem (PPD) e Perda de Inserção de Sondagem (PAL) medidos com uma sonda eletrônica de força constante (Florida Probe®).

Todos os pacientes foram instruídos sobre métodos de higiene bucal usando uma escova de cerdas macias, uma escova de dentes compacta, escovas interdentais e fio dental utilizando a técnica de Bass modificada. O desbridamento total da boca, que consistia em raspagem e alisamento radicular, foi feito em uma única visita para todos os indivíduos do grupo NSPT usando um raspador ultrassônico e curetas Gracey. Além disso, todos os pacientes do grupo NSPT receberam enxaguatório bucal com clorexidina 0,12% (Hexipro®). Eles foram instruídos a enxaguar três vezes ao dia usando 15 ml de cada vez por um período de 14 dias, começando imediatamente após a conclusão do desbridamento bucal completo. Posteriormente, em cada visita de retorno, todos os participantes foram remotivados e a profilaxia profissional foi realizada naqueles do grupo de teste.

15 ml de sangue venoso foram coletados de cada paciente no início do estudo, antes do tratamento e 3 meses após os tratamentos designados. Os níveis de hemoglobina glicosilada (HbA1c) e proteína hs-C reativa sistêmica (hs-CRP) foram avaliados. Os níveis de PCR-us foram avaliados por meio de testes de PCR de alta sensibilidade (PCR-hs). Todas as análises de sangue foram feitas em um laboratório privado (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) sem afiliação ao Departamento de Periodontologia. O teste de HbA1c está alinhado com DCCT e a Garantia de Qualidade do laboratório é certificada pela Bio-Rad Laboratories (EUA), EQAS (External Quality Assurance Services).

As bolsas mais profundas foram identificadas (mínimo 5 bolsas com PPD ≥ 5 mm) e isoladas com rolos de algodão. Isto foi seguido por uma remoção cuidadosa da placa supragengival usando bolinhas de algodão e curetas. Amostras de placa subgengival foram posteriormente coletadas usando curetas estéreis e reunidas em tubo de polietileno estéril livre de DNAse e livre de RNase contendo 1ml de solução tampão fosfato (PBS) e congelada a -800C até o início da análise q-PCR.

A extração automatizada de DNA foi realizada no laboratório usando a máquina QIAcube (Qiagen®). 100 µl de amostra de placa foram colocados em um tubo de centrífuga de 1,5 ml e centrifugados a uma velocidade de 5.000 × g por 10 minutos em uma centrífuga de mesa para obter um pellet. Os pellets foram então colocados no QIAcube-shaker para extração automatizada de DNA pela máquina QIAcube usando o DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit e o conjunto de acessórios QIAmp® DNA. Todos os reagentes fornecidos no kit foram colocados manualmente no suporte de frascos de reagentes da máquina antes do início do processo. Por fim, o protocolo "DNA bacteriano" foi selecionado na lista de protocolos da máquina. Resumidamente, a máquina Qiacube passou por cinco etapas consecutivas que incluíram os processos de lise, incubação, ligação, lavagem e eluição. Ao final do processo, 100µl de DNA eluído estavam disponíveis. O DNA extraído foi então testado quanto à concentração e pureza usando a máquina Nanodrop. O DNA foi então armazenado a -80⁰C antes da identificação bacteriana usando a máquina q-PCR.

A concentração e a pureza do DNA extraído foram determinadas usando a máquina de espectrofotômetro (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers) que foi conectada a um software baseado em PC. 0,1 µl de DNA eluído foi pipetado no braço do pedestal inferior. Um cabo de fibra ótica (a fibra receptora) está embutido neste pedestal. Um segundo cabo de fibra ótica (a fibra de origem) localizado no braço do pedestal superior é então colocado em contato com a amostra líquida, fazendo com que o líquido preencha o espaço entre as extremidades das duas fibras. Uma lâmpada de flash de xenônio pulsada fornece a fonte de luz e um espectrômetro utilizando uma matriz CCD linear analisa a luz que passa pela amostra. A concentração de DNA de ambas as amostras de placa e cepa de referência foram medidas e registradas de acordo. Os DNAs extraídos foram eventualmente armazenados em -20⁰C até o início do procedimento de q-PCR.

A detecção e quantificação de P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia e T.forsythia de amostras de placa foram feitas usando Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems, que foi conectado a um software baseado em PC. A quantificação foi feita projetando-se o valor do limiar do ciclo (Ct) das amostras na curva padrão da quantidade conhecida (concentração) da cepa de referência da bactéria.

Para tanto, uma quantidade conhecida de DNA extraído da bactéria foi diluída seriadamente (diluição de 10 vezes) e submetida à amplificação por RT-PCR. Isso foi feito para fornecer uma curva padrão antes da amplificação de DNA de amostras de placas usando q-PCR. A otimização foi realizada a fim de obter a curva padrão ótima para quantificação. Uma curva padrão de diluição final de 10 vezes das cepas de referência (intervalo de 10 ng/µl- 0,0001 ng/µl) com valor de R2 de 0,956 foi usada como base para a quantificação.

Para determinar a sensibilidade da técnica q-PCR, amostras em série contendo concentrações conhecidas de microorganismos individuais foram processadas para análise q-PCR. A menor concentração que resultou em um produto de PCR positivo foi considerada como a sensibilidade do ensaio.

A amplificação por q-PCR foi feita em um volume total da mistura de reação de 20 µl. Esta mistura continha 2 µl de DNA purificado da amostra de placa/cepa de referência para atuar como modelo de PCR, 10 µl de 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (tampão de PCR, dNTP's, Amplitaq Gold, sinal de referência, uracil N-glicosilase, MgCl2; Applied Bio systems, Foster City, CA, EUA), 1µl Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x) e 7µl de água sem nuclease. Os procedimentos foram conduzidos usando placas de reação de 96 poços.

Todos os componentes da mistura de reação (exceto amostra de DNA) foram adicionados em um tubo de microcentrífuga de 1,5mL. O tubo foi tampado e agitado em vórtex brevemente. Os tubos foram então centrifugados para centrifugar o conteúdo e eliminar as bolhas de ar. A mistura foi então transferida para uma placa de reação de 96 poços e seguida pela adição de 2 µl de amostra de DNA. A placa de reação foi então coberta com cobertura adesiva óptica após todo o poço ter sido ocupado. Esta placa de reação foi novamente centrifugada brevemente para reduzir o conteúdo e garantir que todas as bolhas fossem eliminadas.

Essa mistura foi então submetida a um ciclo inicial de amplificação de 50ºC por 2 minutos e 95ºC por 10 minutos, seguido de 45 ciclos a 95ºC por 15s e 60ºC por 1 minuto. O gráfico de amplificação q-PCR para cada amostra foi analisado para determinar o valor de Ct. O valor de Ct foi então projetado para a curva padrão da tensão de referência para a quantificação.

Comparações de mudanças em PI, GBI, PPD (%) e PAL (%) dentro e entre os grupos foram realizadas usando o teste qui-quadrado. A comparação intragrupo para média de PPD, média de PAL, média de HbA1c, média de PCR e frequência de detecção de P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia e T.forsythia foram avaliadas com o teste t de amostras pareadas, enquanto as comparações intergrupos para as mesmas variáveis foi realizado usando um teste t de amostra independente.