Periodontal sykdom og diabetes mellitus interrelasjon blant voksne malaysere

Etisk godkjenning ble innhentet fra både Medical Ethics Boards ved University Malaya Medical Center (MEC Ref No: 696.9) og University Malaya Dental Center [DF PE1002/0045(P)]. Ett hundre og tolv type 2 diabetespasienter (diagnostisert minst 1 år før studien) mellom 30 og 70 år ble screenet fra poliklinisk diabetesklinikk ved University Malaya Medical Center og totalt 40 pasienter som oppfylte inkludering og ekskludering kriterier ble rekruttert til studien. De rekrutterte pasientene ble deretter registrert ved Periodontology Clinic ved Det odontologiske fakultet, University of Malaya. Pasientinformasjonsark angående studien og muntlige forklaringer ble gitt til alle pasientene. Informert samtykke ble innhentet fra alle rekrutterte pasienter med den forståelse at de kunne trekke seg fra studien når som helst. Screening og behandling av pasienter startet fra januar 2010 til desember 2011.

Prøvestørrelsesberegningen bestemte at 15 forsøkspersoner per behandlingsarm ville gi 80 % kraft til å oppdage en minimumsforskjell på 1 % (11,0 mmol/mol) endring i HbA1c mellom test og kontroll. Følgelig ble et utvalg på 20 forsøkspersoner per arm (40 totalt) rekruttert for å kompensere for mulig frafall i løpet av studieperioden.

Alle pasienter ble tilfeldig fordelt via en myntkast til alderstilpassede NSPT- og OHE-grupper. Etterforsker 1 screenet og registrerte deltakere og tildelte dem til alderstilpassede grupper. Etterforsker 2 utførte den tilfeldige tildelingssekvensen ved å bruke myntkastmetoden for å tildele deltakere til de forskjellige intervensjonene, mens etterforsker 1 utførte all intervensjon. Det var ingen blinding av deltakere eller sensor.

Ettersom kun én undersøker var involvert i studien, ble det utført intra-eksaminator-pålitelighetsvurdering for å validere undersøkerens evne til konstant å reprodusere de kvantitative utfallsmålingene av de kliniske parameterne som ble brukt. Plakkindeksen (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) og Probing Attachment Loss (PAL) ble målt i tidsintervallet på ca. 3 timer. Ved bruk av Kappa-statistikk ble det oppnådd gode samsvar (>0,8) for reproduserbarhet av alle registrerte kliniske parametere.

Alle rekrutterte pasienter gjennomgikk full periodontal vurdering ved baseline, 2 måneder etter tildelt behandling og 3 måneder etter tildelt behandling. Den kliniske undersøkelsen inkluderte Plaque Index (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) og Probing Attachment Loss (PAL) målt med en elektronisk konstantkraftsonde (Florida Probe®).

Alle pasienter ble instruert i munnhygienemetoder ved å bruke en myk tannbørste, en kompakt tuft-tannbørste, interdentale børster og tanntråd ved bruk av den modifiserte Bass-teknikken. Full munndebridering, som besto av skalering og rotplaning, ble utført i ett enkelt besøk for alle forsøkspersoner i NSPT-gruppen ved bruk av en ultralydskaler og Gracey-kyretter. I tillegg ble alle pasienter i NSPT-gruppen gitt en 0,12 % klorheksidin-munnskylling (Hexipro®). De ble bedt om å skylle tre ganger om dagen ved å bruke 15 ml hver gang i en periode på 14 dager som startet umiddelbart etter fullføring av full munnen. Deretter ved hvert tilbakekallingsbesøk ble alle deltakerne re-motivert og profesjonell profylakse ble utført på de i testgruppen.

15 ml veneblod ble samlet inn fra hver pasient ved baseline, før behandling og 3 måneder etter tildelte behandlinger. Nivåer av glykosylert hemoglobin (HbA1c) og systemisk hs-C-reaktivt protein (hs-CRP) ble vurdert. Hs-CRP-nivåer ble vurdert ved hjelp av tester for høysensitiv CRP (hs-CRP). Alle blodundersøkelser ble gjort ved et privat laboratorium (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) uten tilknytning til Institutt for periodontologi. HbA1c-testingen er DCCT-justert og kvalitetssikringen av laboratoriet er sertifisert under Bio-Rad Laboratories (USA), EQAS (External Quality Assurance Services).

De dypeste lommene ble identifisert (minimum 5 lommer med PPD ≥ 5 mm) og isolert med bomullsruller. Dette ble fulgt av forsiktig fjerning av supragingival plakk ved bruk av bomullspellets og kyretter. Subgingivale plakkprøver ble deretter samlet ved bruk av sterile kyretter og slått sammen i sterile DNAse-frie og RNase-frie polyetylenrør inneholdende 1 ml fosfatbufferløsning (PBS) og frosset ved -800C inntil q-PCR-analysen startet.

Automatisert DNA-ekstraksjon ble utført i laboratoriet ved bruk av QIAcube-maskinen (Qiagen®). 100 µl plakkprøve ble plassert i et 1,5 ml sentrifugerør og ble sentrifugert med en hastighet på 5000 x g i 10 minutter på en bordsentrifugemaskin for å oppnå en pellet. Pelletene ble deretter plassert på QIAcube-shakeren for automatisert DNA-ekstraksjon med QIAcube-maskin ved bruk av DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit og QIAmp® DNA-tilbehørsett. Alle reagenser levert i settet ble manuelt plassert i reagensflaskestativet i maskinen før prosessen startet. Til slutt ble "Bakteriell DNA"-protokollen valgt fra maskinens protokollliste. Kort fortalt gjennomgikk Qiacube-maskinen fem påfølgende trinn som inkluderte lyserings-, inkuberings-, bindings-, vask- og elueringsprosesser. På slutten av prosessen var 100 µl eluert DNA tilgjengelig. Det ekstraherte DNAet ble deretter testet for konsentrasjon og renhet ved bruk av Nanodrop-maskin. DNA ble deretter lagret i -80°C før bakteriell identifikasjon ved bruk av q-PCR-maskin.

Konsentrasjonen og renheten til ekstrahert DNA ble bestemt ved bruk av spektrofotometermaskinen (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers) som var koblet til en PC-basert programvare. 0,1 ul eluert DNA ble pipettert på den nedre pidestallarmen. En fiberoptisk kabel (mottaksfiberen) er innebygd i denne sokkelen. En andre fiberoptisk kabel (kildefiberen) plassert i den øvre sokkelarmen bringes deretter i kontakt med væskeprøven, noe som får væsken til å bygge bro over gapet mellom endene av de to fibrene. En pulset xenon-blitslampe gir lyskilden og et spektrometer som bruker en lineær CCD-array analyserer lyset som passerer gjennom prøven. DNA-konsentrasjonen fra både plakkprøver og referansestamme ble målt og registrert deretter. De ekstraherte DNA-ene ble til slutt lagret i -20⁰C inntil starten av q-PCR-prosedyren.

Deteksjonen og kvantifiseringen av P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia og T.forsythia fra plakkprøver ble gjort ved å bruke Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems som var koblet til PC-basert programvare. Kvantifiseringen ble gjort ved å projisere syklusterskelverdien (Ct) til prøvene på standardkurven for den kjente mengden (konsentrasjonen) av bakteriereferansestamme.

For dette formålet ble en kjent mengde ekstrahert DNA fra bakteriene seriefortynnet (10 ganger fortynning) og ble utsatt for RT-PCR-amplifisering. Dette ble gjort for å gi en standardkurve før amplifikasjon av DNA fra plakkprøver ved bruk av q-PCR. Optimalisering ble utført for å få den optimale standardkurven for kvantifisering. En siste 10 gangers fortynningsstandardkurve for referansestammer (fra 10 ng/µl-0,0001 ng/µl) med R2-verdi på 0,956 ble brukt som base for kvantifisering.

For å bestemme sensitiviteten til q-PCR-teknikken, ble serieprøver som inneholdt kjente konsentrasjoner av individuelle mikroorganismer behandlet for q-PCR-analyse. Den laveste konsentrasjonen som resulterte i et positivt PCR-produkt ble sett på som sensitiviteten til analysen.

q-PCR-amplifikasjon ble utført i et totalt reaksjonsblandingsvolum på 20 ul. Denne blandingen inneholdt 2 µl renset DNA fra plakkprøve/referansestamme for å fungere som PCR-template, 10 µl 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (PCR-buffer, dNTP-er, Amplitaq Gold, referansesignal, uracil N-glykosylase, MgCl2; Applied Bio systemer, Foster City, CA, USA), 1 µl Custom Taqman® genuttrykksanalyse (20x) og 7 µl nukleasefritt vann. Prosedyrene ble utført ved å bruke 96-brønners reaksjonsplater.

Alle komponentene i reaksjonsblandingen (unntatt DNA-prøve) ble tilsatt et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Røret ble lukket og vortexet kort. Rørene ble deretter sentrifugert for å spinne ned innholdet og eliminere luftbobler. Blandingen ble deretter overført til en 96-brønners reaksjonsplate og fulgt av tilsetning av 2 ul DNA-prøve. Reaksjonsplaten ble deretter dekket med optisk klebemiddel etter at hele brønnen var blitt opptatt. Denne reaksjonsplaten ble igjen kort sentrifugert for å spinne ned innholdet og for å sikre at alle bobler ble eliminert.

Denne blandingen ble deretter utsatt for en innledende amplifikasjonssyklus på 50 ºC i 2 minutter og 95 ºC i 10 minutter, etterfulgt av 45 sykluser ved 95 ºC i 15 s og 60 ºC i 1 minutt. q-PCR-amplifikasjonsplottet for hver prøve ble analysert for å bestemme Ct-verdien. Ct-verdien ble deretter projisert til standardkurven for referansebelastning for kvantifiseringen.

Sammenligninger av endringer i PI, GBI, PPD(%) og PAL (%) både innenfor og mellom gruppene ble utført ved bruk av kjikvadrattesten. Intragruppesammenligning for gjennomsnittlig PPD, gjennomsnittlig PAL, gjennomsnittlig HbA1c, gjennomsnittlig CRP og frekvens for påvisning av P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia og T.forsythia ble vurdert med den parede prøven t-testen, mens intergruppesammenlikninger for de samme variablene ble oppnådd ved hjelp av en uavhengig prøve t-test.