Der Zusammenhang zwischen Parodontitis und Diabetes mellitus bei erwachsenen Malaysiern

Die ethische Genehmigung wurde sowohl von den medizinischen Ethikausschüssen des University Malaya Medical Center (MEC-Ref.-Nr.: 696.9) als auch des University Malaya Dental Center [DF PE1002/0045(P)] eingeholt. Einhundertzwölf Typ-2-Diabetiker (mindestens ein Jahr vor der Studie diagnostiziert) im Alter zwischen 30 und 70 Jahren wurden in der ambulanten Diabetesklinik des University Malaya Medical Center untersucht und insgesamt 40 Patienten, die die Einschluss- und Ausschlusskriterien erfüllten Kriterien wurden für die Studie rekrutiert. Die rekrutierten Patienten wurden dann in der Klinik für Parodontologie der Fakultät für Zahnmedizin der Universität Malaya registriert. Allen Patienten wurden Patienteninformationsblätter zur Studie und mündliche Erklärungen ausgehändigt. Von allen rekrutierten Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt, mit der Maßgabe, dass sie jederzeit aus der Studie aussteigen können. Das Screening und die Behandlung der Patienten begannen von Januar 2010 bis Dezember 2011.

Bei der Berechnung der Stichprobengröße wurde festgestellt, dass 15 Probanden pro Behandlungsarm eine Leistung von 80 % bereitstellen würden, um eine minimale Differenz von 1 % (11,0 mmol/mol) HbA1c-Änderung zwischen Test und Kontrolle festzustellen. Dementsprechend wurde eine Stichprobe von 20 Probanden pro Arm (insgesamt 40) rekrutiert, um mögliche Studienabbrecher während des Studienzeitraums zu kompensieren.

Alle Patienten wurden per Münzwurf nach dem Zufallsprinzip altersentsprechenden NSPT- und OHE-Gruppen zugeordnet. Prüfer 1 überprüfte und rekrutierte die Teilnehmer und ordnete sie altersentsprechenden Gruppen zu. Forscher 2 führte die zufällige Zuordnungssequenz mithilfe der Münzwurfmethode durch, um die Teilnehmer den verschiedenen Interventionen zuzuordnen, während Forscher 1 alle Interventionen durchführte. Es kam zu keiner Verblindung der Teilnehmer oder Prüfer.

Da nur ein Prüfer an der Studie beteiligt war, wurde eine prüferinterne Zuverlässigkeitsbewertung durchgeführt, um die Fähigkeit des Prüfers zu validieren, die quantitativen Ergebnismessungen der verwendeten klinischen Parameter kontinuierlich zu reproduzieren. Der Plaque-Index (PI), der Zahnfleischblutungsindex (GBI), die Sondierungstaschentiefe (PPD) und der Sondierungs-Attachment-Verlust (PAL) wurden im Zeitintervall von etwa 3 Stunden gemessen. Mithilfe der Kappa-Statistik wurden gute Übereinstimmungen (>0,8) für die Reproduzierbarkeit aller aufgezeichneten klinischen Parameter erzielt.

Alle rekrutierten Patienten wurden zu Studienbeginn, 2 Monate nach der zugewiesenen Behandlung und 3 Monate nach der zugewiesenen Behandlung einer vollständigen parodontalen Untersuchung unterzogen. Die klinische Untersuchung umfasste den Plaque-Index (PI), den Zahnfleischblutungsindex (GBI), die Sondierungstaschentiefe (PPD) und den Sondierungs-Anhangsverlust (PAL), gemessen mit einer elektronischen Konstantkraftsonde (Florida Probe®).

Alle Patienten wurden in die Mundhygiene unter Verwendung einer Zahnbürste mit weichen Borsten, einer Kompaktzahnbürste, Interdentalbürsten und Zahnseide unter Verwendung der modifizierten Bass-Technik eingewiesen. Das vollständige Debridement des Mundes, das aus Zahnsteinentfernung und Wurzelglättung bestand, wurde bei allen Probanden in der NSPT-Gruppe in einem einzigen Besuch mit einem Ultraschall-Scaler und Gracey-Küretten durchgeführt. Zusätzlich erhielten alle Patienten der NSPT-Gruppe eine 0,12 %ige Chlorhexidin-Mundspülung (Hexipro®). Sie wurden angewiesen, über einen Zeitraum von 14 Tagen dreimal täglich mit jeweils 15 ml zu spülen, beginnend unmittelbar nach Abschluss der vollständigen Mundreinigung. Danach wurden bei jedem Rückrufbesuch alle Teilnehmer neu motiviert und bei den Teilnehmern der Testgruppe wurde eine professionelle Prophylaxe durchgeführt.

Zu Studienbeginn, vor der Behandlung und 3 Monate nach den zugewiesenen Behandlungen wurden jedem Patienten 15 ml venöses Blut entnommen. Bewertet wurden die Werte von glykosyliertem Hämoglobin (HbA1c) und systemischem hs-C-reaktivem Protein (hs-CRP). Die Hs-CRP-Werte wurden mithilfe von Tests für hochempfindliches CRP (hs-CRP) bestimmt. Alle Blutuntersuchungen wurden in einem privaten Labor (Gnosis Laboratories Sdn.) durchgeführt. Bhd) ohne Zugehörigkeit zur Abteilung für Parodontologie. Die HbA1c-Tests sind DCCT-konform und die Qualitätssicherung des Labors ist nach Bio-Rad Laboratories (USA), EQAS (External Quality Assurance Services) zertifiziert.

Die tiefsten Taschen wurden identifiziert (mindestens 5 Taschen mit PPD ≥ 5 mm) und mit Watterollen isoliert. Anschließend erfolgte die sorgfältige Entfernung der supragingivalen Plaque mittels Wattepellets und Küretten. Anschließend wurden subgingivale Plaqueproben mit sterilen Küretten gesammelt und in sterilen DNAse- und RNase-freien Polyethylenröhrchen mit 1 ml Phosphatpufferlösung (PBS) gesammelt und bis zum Beginn der q-PCR-Analyse bei -80 °C eingefroren.

Die automatisierte DNA-Extraktion wurde im Labor mit der QIAcube-Maschine (Qiagen®) durchgeführt. 100 µl Plaqueprobe wurden in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und 10 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 5.000 × g auf einer Tischzentrifuge zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten. Die Pellets wurden dann auf den QIAcube-Shaker gegeben, um die DNA mithilfe des QIAcube-Geräts unter Verwendung des DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit und des QIAmp® DNA-Zubehörsets automatisch zu extrahieren. Alle im Kit enthaltenen Reagenzien wurden vor Beginn des Prozesses manuell in das Reagenzflaschengestell im Gerät gegeben. Abschließend wurde das Protokoll „Bacterial DNA“ aus der Protokollliste der Maschine ausgewählt. Kurz gesagt, die Qiacube-Maschine durchlief fünf aufeinanderfolgende Schritte, darunter Lyse-, Inkubations-, Bindungs-, Wasch- und Elutionsprozesse. Am Ende des Prozesses standen 100 µl eluierte DNA zur Verfügung. Die extrahierte DNA wurde dann mit einem Nanodrop-Gerät auf Konzentration und Reinheit getestet. Die DNA wurde dann bei -80 °C gelagert, bevor die Bakterien mithilfe eines q-PCR-Geräts identifiziert wurden.

Die Konzentration und Reinheit der extrahierten DNA wurde mit dem Spektrophotometergerät (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers) bestimmt, das mit einer PC-basierten Software verbunden war. 0,1 µl der eluierten DNA wurden auf den unteren Sockelarm pipettiert. In diesem Sockel ist ein Glasfaserkabel (die Empfangsfaser) eingebettet. Ein zweites Glasfaserkabel (die Quellfaser), das sich im oberen Sockelarm befindet, wird dann mit der flüssigen Probe in Kontakt gebracht, wodurch die Flüssigkeit den Spalt zwischen den Enden der beiden Fasern überbrückt. Eine gepulste Xenon-Blitzlampe dient als Lichtquelle und ein Spektrometer mit linearem CCD-Array analysiert das durch die Probe hindurchtretende Licht. Die DNA-Konzentration sowohl der Plaque-Proben als auch des Referenzstamms wurde gemessen und entsprechend aufgezeichnet. Die extrahierten DNAs wurden schließlich bis zum Beginn des q-PCR-Verfahrens bei -20 °C gelagert.

Der Nachweis und die Quantifizierung von P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia und T.forsythia aus Plaqueproben erfolgten mit Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems, das mit PC-basierter Software verbunden war. Die Quantifizierung erfolgte durch Projizieren des Zyklusschwellenwerts (Ct) der Proben auf die Standardkurve der bekannten Menge (Konzentration) des Bakterienreferenzstamms.

Zu diesem Zweck wurde eine bekannte Menge extrahierter DNA der Bakterien seriell verdünnt (10-fache Verdünnung) und einer RT-PCR-Amplifikation unterzogen. Dies wurde durchgeführt, um vor der Amplifikation von DNA aus Plaque-Proben mittels q-PCR eine Standardkurve zu erstellen. Es wurde eine Optimierung durchgeführt, um die optimale Standardkurve für die Quantifizierung zu erhalten. Als Grundlage für die Quantifizierung wurde eine endgültige 10-fache Verdünnungsstandardkurve von Referenzstämmen (Bereich von 10 ng/µl bis 0,0001 ng/µl) mit einem R2-Wert von 0,956 verwendet.

Um die Empfindlichkeit der q-PCR-Technik zu bestimmen, wurden Serienproben mit bekannten Konzentrationen einzelner Mikroorganismen für die q-PCR-Analyse verarbeitet. Die niedrigste Konzentration, die zu einem positiven PCR-Produkt führte, wurde als Empfindlichkeit des Tests angesehen.

Die q-PCR-Amplifikation wurde in einem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung von 20 µl durchgeführt. Diese Mischung enthielt 2 µl gereinigte DNA aus Plaque-Probe/Referenzstamm als PCR-Matrize, 10 µl 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (PCR-Puffer, dNTPs, Amplitaq Gold, Referenzsignal, Uracil-N-Glykosylase, MgCl2; Applied Bio systems, Foster City, CA, USA), 1 µl Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x) und 7 µl nukleasefreies Wasser. Die Verfahren wurden unter Verwendung von 96-Well-Reaktionsplatten durchgeführt.

Alle Komponenten der Reaktionsmischung (außer der DNA-Probe) wurden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde verschlossen und kurz gevortext. Anschließend wurden die Röhrchen zentrifugiert, um den Inhalt zu zerkleinern und Luftblasen zu entfernen. Die Mischung wurde dann in eine Reaktionsplatte mit 96 Vertiefungen überführt und anschließend wurden 2 µl DNA-Probe hinzugefügt. Nachdem die gesamte Vertiefung belegt war, wurde die Reaktionsplatte dann mit einer optischen Klebeabdeckung abgedeckt. Diese Reaktionsplatte wurde erneut kurz zentrifugiert, um den Inhalt zu zerkleinern und sicherzustellen, dass alle Blasen entfernt wurden.

Diese Mischung wurde dann einem anfänglichen Amplifikationszyklus von 2 Minuten bei 50 °C und 10 Minuten bei 95 °C unterzogen, gefolgt von 45 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 1 Minute. Das q-PCR-Amplifikationsdiagramm für jede Probe wurde analysiert, um den Ct-Wert zu bestimmen. Der Ct-Wert wurde dann zur Quantifizierung auf die Standardkurve der Referenzbelastung projiziert.

Vergleiche der Veränderungen von PI, GBI, PPD (%) und PAL (%) sowohl innerhalb als auch zwischen den Gruppen wurden mithilfe des Chi-Quadrat-Tests durchgeführt. Der gruppeninterne Vergleich für den mittleren PPD, den mittleren PAL, den mittleren HbA1c, den mittleren CRP und die Häufigkeit des Nachweises von P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia und T.forsythia wurde mit dem t-Test für gepaarte Stichproben beurteilt, wohingegen Vergleiche zwischen den Gruppen für dieselben Variablen durchgeführt wurden wurde mithilfe eines unabhängigen Stichproben-T-Tests durchgeführt.