Choroby przyzębia i cukrzyca Wzajemne powiązania wśród dorosłych Malezyjczyków

Zgodę etyczną uzyskano zarówno od Komisji Etyki Lekarskiej Centrum Medycznego Uniwersytetu Malaya (nr ref. MEC: 696.9), jak i Centrum Stomatologicznego Uniwersytetu Malaya [DF PE1002/0045(P)]. Stu dwunastu pacjentów z cukrzycą typu 2 (zdiagnozowaną co najmniej 1 rok przed badaniem) w wieku od 30 do 70 lat zostało przebadanych w ambulatoryjnej klinice diabetologicznej Uniwersyteckiego Malaya Medical Center i łącznie 40 pacjentów, którzy spełnili kryteria włączenia i wyłączenia do badania wybrano kryteria. Zrekrutowani pacjenci zostali następnie zarejestrowani w Klinice Periodontologii na Wydziale Stomatologii Uniwersytetu Malaya. Wszystkim pacjentom przekazano karty informacyjne dotyczące badania i ustne wyjaśnienia. Świadomą zgodę uzyskano od wszystkich rekrutowanych pacjentów ze zrozumieniem, że mogą wycofać się z badania w dowolnym momencie. Badania przesiewowe i leczenie pacjentów rozpoczęto od stycznia 2010 roku do grudnia 2011 roku.

Obliczenia wielkości próby wykazały, że 15 pacjentów na ramię leczenia zapewniłoby 80% mocy do wykrycia minimalnej różnicy wynoszącej 1% (11,0 mmol/mol) zmiany HbA1c między badaniem a kontrolą. W związku z tym zrekrutowano próbkę 20 osób na ramię (w sumie 40), aby zrekompensować możliwe wypadnięcia z badania w okresie badania.

Wszyscy pacjenci zostali losowo przydzieleni za pomocą rzutu monetą do dobranych wiekowo grup NSPT i OHE. Badacz 1 sprawdził i zapisał uczestników i przydzielił ich do grup dobranych wiekowo. Badacz 2 wykonał sekwencję losowego przydziału, stosując metodę rzutu monetą, aby przypisać uczestników do różnych interwencji, podczas gdy Badacz 1 wykonał wszystkie interwencje. Nie było oślepiania uczestników ani egzaminatora.

Ponieważ w badaniu uczestniczył tylko jeden egzaminator, przeprowadzono ocenę wiarygodności wewnątrz egzaminatora w celu sprawdzenia zdolności egzaminatora do ciągłego odtwarzania ilościowych pomiarów wyników zastosowanych parametrów klinicznych. Wskaźnik płytki nazębnej (PI), wskaźnik krwawienia z dziąseł (GBI), głębokość kieszonek sondujących (PPD) i utratę przyczepu sondującego (PAL) mierzono w przedziale czasowym około 3 godzin. Wykorzystując statystyki Kappa, uzyskano dobre zgodności (>0,8) dla odtwarzalności wszystkich zarejestrowanych parametrów klinicznych.

Wszyscy zrekrutowani pacjenci przeszli pełną ocenę periodontologiczną na początku badania, 2 miesiące po przydzielonym leczeniu i 3 miesiące po przydzielonym leczeniu. Badanie kliniczne obejmowało wskaźnik płytki nazębnej (PI), wskaźnik krwawienia dziąsłowego (GBI), głębokość kieszonki sondującej (PPD) oraz utratę przyczepu sondującego (PAL) mierzone za pomocą elektronicznej sondy o stałej sile (Florida Probe®).

Wszyscy pacjenci zostali poinstruowani w zakresie higieny jamy ustnej przy użyciu szczoteczki z miękkim włosiem, szczoteczki z pęczków kompaktowych, szczoteczek międzyzębowych oraz nici dentystycznych zmodyfikowaną techniką Bassa. Pełne oczyszczenie jamy ustnej, które składało się ze skalingu i wygładzenia korzeni, zostało wykonane podczas jednej wizyty u wszystkich pacjentów z grupy NSPT przy użyciu skalera ultradźwiękowego i kiret Gracey. Dodatkowo wszystkim pacjentom w grupie NSPT podano płyn do płukania jamy ustnej z 0,12% chlorheksydyną (Hexipro®). Zostali poinstruowani, aby płukać trzy razy dziennie, każdorazowo po 15 ml, przez okres 14 dni, rozpoczynając natychmiast po zakończeniu pełnego oczyszczenia jamy ustnej. Następnie podczas każdej wizyty przypominającej wszyscy uczestnicy byli ponownie motywowani, a osoby z grupy testowej przeprowadzano profesjonalną profilaktykę.

Od każdego pacjenta pobrano 15 ml krwi żylnej na początku badania, przed leczeniem i 3 miesiące po przydzielonym leczeniu. Oceniono poziomy hemoglobiny glikozylowanej (HbA1c) i ogólnoustrojowego białka hs-C-reaktywnego (hs-CRP). Poziomy Hs-CRP oceniano za pomocą testów na CRP o wysokiej czułości (hs-CRP). Wszystkie badania krwi przeprowadzono w prywatnym laboratorium (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) bez przynależności do Oddziału Periodontologii. Test HbA1c jest zgodny z DCCT, a laboratorium zapewniania jakości jest certyfikowane przez Bio-Rad Laboratories (USA), EQAS (zewnętrzne usługi zapewniania jakości).

Zidentyfikowano najgłębsze kieszonki (minimum 5 kieszonek o PPD ≥ 5 mm) i wyizolowano za pomocą wacików. Następnie ostrożnie usunięto naddziąsłową płytkę nazębną za pomocą wacików i łyżeczek. Próbki płytki nazębnej poddziąsłowej następnie zebrano przy użyciu sterylnych kiret i połączono w sterylnej probówce polietylenowej wolnej od DNaz i RNaz, zawierającej 1 ml roztworu buforu fosforanowego (PBS) i zamrożono w temperaturze -80°C aż do rozpoczęcia analizy q-PCR.

Zautomatyzowaną ekstrakcję DNA przeprowadzono w laboratorium przy użyciu urządzenia QIAcube (Qiagen®). 100 µl próbki płytki nazębnej umieszczono w 1,5 ml probówce do wirowania i wirowano z prędkością 5000 x g przez 10 minut na wirówce stołowej w celu uzyskania osadu. Następnie osady umieszczono na wytrząsarce QIAcube w celu zautomatyzowanej ekstrakcji DNA za pomocą urządzenia QIAcube przy użyciu zestawu DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit i zestawu akcesoriów QIAmp® DNA. Wszystkie odczynniki dostarczone w zestawie zostały ręcznie umieszczone w stojaku na butelki z odczynnikami w maszynie przed rozpoczęciem procesu. Ostatecznie z listy protokołów maszyny wybrano protokół „DNA bakteryjne”. W skrócie, maszyna Qiacube przeszła pięć kolejnych etapów, które obejmowały procesy lizy, inkubacji, wiązania, przemywania i elucji. Pod koniec procesu dostępne było 100 µl eluowanego DNA. Wyekstrahowany DNA został następnie przetestowany pod kątem stężenia i czystości za pomocą maszyny Nanodrop. Następnie DNA przechowywano w -80⁰C przed identyfikacją bakterii za pomocą maszyny q-PCR.

Stężenie i czystość wyekstrahowanego DNA określono za pomocą spektrofotometru (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers), który był połączony z oprogramowaniem komputerowym. 0,1 µl eluowanego DNA odpipetowano na dolne ramię podstawy. Kabel światłowodowy (światłowód odbiorczy) jest osadzony w tej podstawie. Drugi kabel światłowodowy (światłowód źródłowy) umieszczony w górnym ramieniu podstawy jest następnie stykany z próbką cieczy, co powoduje, że ciecz wypełnia szczelinę między końcami dwóch włókien. Pulsacyjna ksenonowa lampa błyskowa zapewnia źródło światła, a spektrometr wykorzystujący liniową matrycę CCD analizuje światło przechodzące przez próbkę. Zmierzono i odpowiednio zarejestrowano stężenie DNA z obu próbek łysinek i szczepu referencyjnego. Wyekstrahowane DNA ostatecznie przechowywano w temperaturze -20⁰C do czasu rozpoczęcia procedury q-PCR.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia i T.forsythia z próbek płytki nazębnej przeprowadzono przy użyciu systemów Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems, które były podłączone do oprogramowania komputerowego. Kwantyfikację przeprowadzono przez rzutowanie wartości progowej cyklu (Ct) próbek na krzywą standardową znanej ilości (stężenia) referencyjnego szczepu bakterii.

W tym celu znaną ilość wyekstrahowanego DNA bakterii rozcieńczono seryjnie (10-krotne rozcieńczenie) i poddano amplifikacji RT-PCR. Zrobiono to, aby uzyskać krzywą standardową przed amplifikacją DNA z próbek łysinek przy użyciu q-PCR. Optymalizację przeprowadzono w celu uzyskania optymalnej krzywej wzorcowej do kwantyfikacji. Końcową krzywą standardową 10-krotnego rozcieńczenia szczepów odniesienia (zakres od 10 ng/µl do 0,0001 ng/µl) z wartością R2 0,956 zastosowano jako podstawę do oznaczania ilościowego.

Aby określić czułość techniki q-PCR, seryjne próbki zawierające znane stężenia poszczególnych mikroorganizmów poddano analizie q-PCR. Najniższe stężenie, które dało pozytywny produkt PCR, uznano za czułość testu.

Amplifikację q-PCR przeprowadzono w całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej 20 ul. Ta mieszanina zawierała 2 µl oczyszczonego DNA z próbki łysinki/szczepu referencyjnego do działania jako matryca do PCR, 10 µl 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (bufor do PCR, dNTP, Amplitaq Gold, sygnał referencyjny, N-glikozylaza uracylu, MgCl2; Applied Bio systems, Foster City, CA, USA), 1 µl niestandardowego testu ekspresji genów Taqman® (20x) i 7 µl wody wolnej od nukleaz. Procedury przeprowadzono stosując 96-studzienkowe płytki reakcyjne.

Wszystkie składniki mieszaniny reakcyjnej (z wyjątkiem próbki DNA) dodano do 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Probówkę zamknięto i krótko worteksowano. Następnie probówki odwirowano w celu odwirowania zawartości i usunięcia pęcherzyków powietrza. Następnie mieszaninę przeniesiono do 96-studzienkowej płytki reakcyjnej, a następnie dodano 2 ul próbki DNA. Następnie płytkę reakcyjną przykryto optyczną warstwą kleju po zajęciu całej studzienki. Tę płytkę reakcyjną ponownie krótko odwirowano w celu odwirowania zawartości i upewnienia się, że wszystkie pęcherzyki zostały wyeliminowane.

Tę mieszaninę następnie poddano początkowemu cyklowi amplifikacji w 50°C przez 2 minuty i 95°C przez 10 minut, a następnie 45 cyklom w 95°C przez 15 s i 60°C przez 1 minutę. Wykres amplifikacji q-PCR dla każdej próbki analizowano w celu określenia wartości Ct. Następnie wartość Ct rzutowano na krzywą wzorcową szczepu odniesienia w celu oznaczenia ilościowego.

Porównania zmian PI, GBI, PPD(%) i PAL (%) zarówno w obrębie grup, jak i pomiędzy grupami przeprowadzono za pomocą testu chi-kwadrat. Porównanie wewnątrzgrupowe dla średniego PPD, średniego PAL, średniego HbA1c, średniego CRP i częstości wykrywania P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia i T.forsythia oceniono za pomocą testu t dla par próbek, podczas gdy porównania międzygrupowe dla tych samych zmiennych przeprowadzono za pomocą niezależnego testu t próbki.