De onderlinge relatie tussen parodontitis en diabetes mellitus bij volwassen Maleisiërs

Ethische goedkeuring werd verkregen van zowel de Medical Ethics Boards van University Malaya Medical Center (MEC Ref No: 696.9) als University Malaya Dental Center [DF PE1002/0045(P)]. Honderdtwaalf type 2 diabetespatiënten (gediagnosticeerd ten minste 1 jaar voorafgaand aan het onderzoek) in de leeftijd van 30 tot 70 jaar werden gescreend vanuit de poliklinische diabeteskliniek van het University Malaya Medical Center en in totaal 40 patiënten die voldeden aan de inclusie- en exclusiecriteria. criteria werden aangeworven voor de studie. De gerekruteerde patiënten werden vervolgens geregistreerd bij de Parodontologiekliniek van de Faculteit der Tandheelkunde, Universiteit van Malaya. Patiënteninformatiebladen met betrekking tot het onderzoek en mondelinge uitleg werden aan alle patiënten gegeven. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle gerekruteerde patiënten met dien verstande dat zij zich op elk moment uit het onderzoek konden terugtrekken. Screening en behandeling van patiënten begon van januari 2010 tot december 2011.

De berekening van de steekproefomvang bepaalde dat 15 proefpersonen per behandelingsarm 80% vermogen zouden leveren om een ​​minimaal verschil van 1% (11,0 mmol/mol) verandering in HbA1c tussen test en controle te detecteren. Dienovereenkomstig werd een steekproef van 20 proefpersonen per arm (40 in totaal) gerekruteerd om mogelijke uitval tijdens de onderzoeksperiode te compenseren.

Alle patiënten werden willekeurig toegewezen via een toss aan op leeftijd afgestemde NSPT- en OHE-groepen. Onderzoeker 1 screende en schreef deelnemers in en wees ze toe aan leeftijdsgroepen. Onderzoeker 2 voerde de willekeurige toewijzingsreeks uit met behulp van de methode voor het opgooien van munten om deelnemers aan de verschillende interventies toe te wijzen, terwijl onderzoeker 1 alle interventies uitvoerde. Er was geen verblinding van deelnemers of examinator.

Aangezien er slechts één onderzoeker bij het onderzoek betrokken was, werd een intra-onderzoekerbetrouwbaarheidsbeoordeling uitgevoerd om het vermogen van de onderzoeker om constant de kwantitatieve uitkomstmetingen van de gebruikte klinische parameters te reproduceren, te valideren. De Plaque Index (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) en Probing Attachment Loss (PAL) werden gemeten in een tijdsinterval van ongeveer 3 uur. Gebruikmakend van Kappa-statistieken werden goede overeenkomsten (>0,8) verkregen voor reproduceerbaarheid van alle geregistreerde klinische parameters.

Alle gerekruteerde patiënten ondergingen een volledige parodontale beoordeling bij baseline, 2 maanden na de toegewezen behandeling en 3 maanden na de toegewezen behandeling. Het klinisch onderzoek omvatte Plaque Index (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) en Probing Attachment Loss (PAL) gemeten met een elektronische constante-krachtsonde (Florida Probe®).

Alle patiënten werden geïnstrueerd in methoden voor mondhygiëne met behulp van een tandenborstel met zachte haren, een tandenborstel met compacte plukjes, interdentale ragers en flosdraad met behulp van de gemodificeerde Bass-techniek. Een volledig debridement van de mond, dat bestond uit het verwijderen van schalen en het schaven van de wortels, werd bij alle proefpersonen in de NSPT-groep in één bezoek uitgevoerd met behulp van een ultrasone scaler en Gracey-curettes. Bovendien kregen alle patiënten in de NSPT-groep een mondspoeling met 0,12% chloorhexidine (Hexipro®). Ze kregen de instructie om drie keer per dag te spoelen met telkens 15 ml gedurende een periode van 14 dagen, beginnend onmiddellijk na voltooiing van het volledige debridement van de mond. Daarna werden bij elk terugroepbezoek alle deelnemers opnieuw gemotiveerd en werd professionele profylaxe uitgevoerd op degenen in de testgroep.

Bij elke patiënt werd 15 ml veneus bloed afgenomen bij baseline, voorafgaand aan de behandeling en 3 maanden na toegewezen behandelingen. Niveaus van geglycosyleerd hemoglobine (HbA1c) en systemisch hs-C-reactief proteïne (hs-CRP) werden beoordeeld. Hs-CRP-niveaus werden beoordeeld met behulp van tests voor hooggevoelige CRP (hs-CRP). Alle bloedonderzoeken werden uitgevoerd in een privélaboratorium (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) zonder aansluiting bij de afdeling Parodontologie. De HbA1c-testen zijn DCCT-afgelijnd en de kwaliteitsborging van het laboratorium is gecertificeerd onder Bio-Rad Laboratories (VS), EQAS (External Quality Assurance Services).

De diepste zakken werden geïdentificeerd (minimaal 5 zakken met PPD ≥ 5 mm) en geïsoleerd met wattenrollen. Dit werd gevolgd door zorgvuldige verwijdering van supragingivale plaque met behulp van wattenbolletjes en curettes. Subgingivale plaquemonsters werden vervolgens verzameld met behulp van steriele curettes en samengevoegd in steriele DNAse-vrije en RNase-vrije polyethyleenbuis met 1 ml fosfaatbufferoplossing (PBS) en ingevroren bij -80°C tot aanvang van q-PCR-analyse.

Geautomatiseerde DNA-extractie werd uitgevoerd in het laboratorium met behulp van de QIAcube-machine (Qiagen®). 100 µl plaquemonster werd in een centrifugebuis van 1,5 ml geplaatst en werd gedurende 10 minuten gecentrifugeerd met een snelheid van 5.000 x g op een tafelmodel centrifuge om een ​​pellet te verkrijgen. De pellets werden vervolgens op de QIAcube-shaker geplaatst voor geautomatiseerde DNA-extractie door een QIAcube-machine met behulp van de DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit en de QIAmp® DNA-accessoireset. Alle reagentia die in de kit zijn geleverd, zijn vóór de start van het proces handmatig in het reagensflessenrek in de machine geplaatst. Uiteindelijk werd het protocol "Bacterieel DNA" geselecteerd uit de protocollijst van de machine. In het kort onderging de Qiacube-machine vijf opeenvolgende stappen, waaronder lysis-, incubatie-, bind-, was- en elutieprocessen. Aan het einde van het proces was 100 µl geëlueerd DNA beschikbaar. Het geëxtraheerde DNA werd vervolgens getest op concentratie en zuiverheid met behulp van de Nanodrop-machine. Het DNA werd vervolgens bewaard bij -80⁰C vóór bacteriële identificatie met behulp van een q-PCR-machine.

De concentratie en zuiverheid van geëxtraheerd DNA werd bepaald met behulp van de spectrofotometermachine (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 spectrofotometers) die was verbonden met op pc gebaseerde software. 0,1 µl geëlueerd DNA werd op de onderste arm van het voetstuk gepipetteerd. In dit voetstuk is een glasvezelkabel (de ontvangende vezel) ingebed. Een tweede glasvezelkabel (de bronvezel) die zich in de bovenste arm van het voetstuk bevindt, wordt vervolgens in contact gebracht met het vloeistofmonster, waardoor de vloeistof de opening tussen de uiteinden van de twee vezels overbrugt. Een gepulseerde xenon-flitslamp levert de lichtbron en een spectrometer die gebruikmaakt van een lineaire CCD-array analyseert het licht dat door het monster gaat. De DNA-concentratie van zowel plaquemonsters als referentiestam werd dienovereenkomstig gemeten en geregistreerd. De geëxtraheerde DNA's werden uiteindelijk bewaard bij -20⁰C tot het begin van de q-PCR-procedure.

De detectie en kwantificering van P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia en T. forsythia uit plaquemonsters werd uitgevoerd met behulp van Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR-systemen die waren verbonden met pc-gebaseerde software. De kwantificering werd uitgevoerd door de cyclusdrempelwaarde (Ct) van de monsters te projecteren op de standaardkromme van de bekende hoeveelheid (concentratie) bacteriereferentiestam.

Hiertoe werd een bekende hoeveelheid geëxtraheerd DNA van de bacteriën serieel verdund (10-voudige verdunning) en onderworpen aan RT-PCR-amplificatie. Dit werd gedaan om een ​​standaardcurve te verkrijgen voorafgaand aan amplificatie van DNA uit plaquemonsters met behulp van q-PCR. Optimalisatie werd uitgevoerd om de optimale standaardkromme voor kwantificering te verkrijgen. Een uiteindelijke 10-voudige verdunningsstandaardcurve van referentiestammen (bereik van 10 ng/µl- 0,0001 ng/µl) met R2-waarde van 0,956 werd gebruikt als basis voor kwantificering.

Om de gevoeligheid van de q-PCR-techniek te bepalen, werden seriële monsters met bekende concentraties van individuele micro-organismen verwerkt voor q-PCR-analyse. De laagste concentratie die resulteerde in een positief PCR-product werd beschouwd als de gevoeligheid van de assay.

q-PCR-amplificatie werd uitgevoerd in een totaal volume van het reactiemengsel van 20 µl. Dit mengsel bevatte 2 µl gezuiverd DNA uit plaquemonster/referentiestam om als PCR-template te dienen, 10 µl 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (PCR-buffer, dNTP's, Amplitaq Gold, referentiesignaal, uracil N-glycosylase, MgCl2; Applied Bio systems, Foster City, CA, VS), 1 µl Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x) en 7 µl nucleasevrij water. De procedures werden uitgevoerd met behulp van reactieplaten met 96 putjes.

Alle componenten van het reactiemengsel (behalve het DNA-monster) werden toegevoegd aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml. De buis werd afgesloten en kort gevortext. De buisjes werden vervolgens gecentrifugeerd om de inhoud naar beneden te draaien en luchtbellen te verwijderen. Het mengsel werd vervolgens overgebracht naar een reactieplaat met 96 putjes en gevolgd door toevoeging van 2 µl DNA-monster. De reactieplaat werd vervolgens bedekt met een optisch hechtende afdekking nadat het gehele putje was bezet. Deze reactieplaat werd opnieuw kort gecentrifugeerd om de inhoud naar beneden te draaien en om ervoor te zorgen dat alle bellen werden verwijderd.

Dit mengsel werd vervolgens onderworpen aan een initiële amplificatiecyclus van 50°C gedurende 2 minuten en 95°C gedurende 10 minuten, gevolgd door 45 cycli bij 95°C gedurende 15 seconden en 60°C gedurende 1 minuut. De q-PCR-amplificatiegrafiek voor elk monster werd geanalyseerd om de Ct-waarde te bepalen. De Ct-waarde werd vervolgens geprojecteerd op de standaardcurve van de referentiespanning voor de kwantificering.

Vergelijkingen van veranderingen in PI, GBI, PPD(%) en PAL (%) zowel binnen als tussen de groepen werden uitgevoerd met behulp van de chikwadraattoets. Intragroepsvergelijking voor gemiddelde PPD, gemiddelde PAL, gemiddelde HbA1c, gemiddelde CRP en frequentie van detectie van P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia en T. forsythia werden beoordeeld met de paired sample t-test, terwijl intergroepsvergelijkingen voor dezelfde variabelen werd bereikt met behulp van een onafhankelijke steekproef t-test.