Parodontaalitauti ja diabetes mellitus vuorovaikutuksessa aikuisten malesialaisten keskuudessa

Eettinen hyväksyntä saatiin sekä Malayan yliopiston lääketieteellisen keskuksen lääketieteellisiltä eettisiltä lautakunnilta (MEC-viitenumero: 696.9) että Malayan yliopiston hammaslääkärikeskukselta [DF PE1002/0045(P)]. Malayan yliopiston lääketieteellisen keskuksen avohoitodiabetesklinikalta seulottiin satakaksitoista tyypin 2 diabeetikkoa (diagnoosoitu vähintään 1 vuosi ennen tutkimusta) iältään 30–70-vuotiaita ja yhteensä 40 potilasta, jotka täyttivät sisällyttämis- ja poissulkemisvaatimukset. tutkimukseen valittiin kriteerit. Rekrytoidut potilaat rekisteröitiin sitten Malayan yliopiston hammaslääketieteellisen tiedekunnan parodontologian klinikalle. Kaikille potilaille annettiin potilastietolomakkeet tutkimuksesta ja suulliset selitykset. Kaikilta rekrytoiduilta potilailta saatiin tietoinen suostumus, jotta he voisivat vetäytyä tutkimuksesta milloin tahansa. Potilaiden seulonta ja hoito aloitettiin tammikuusta 2010 joulukuuhun 2011.

Otoskoon laskeminen määritti, että 15 koehenkilöä hoitohaarassa antaisi 80 % tehon havaitakseen HbA1c:n 1 %:n (11,0 mmol/mol) muutoksen vähimmäiseron testin ja kontrollin välillä. Vastaavasti 20 koehenkilön otos per haara (yhteensä 40) rekrytoitiin korvaamaan mahdollisia keskeyttämisiä tutkimusjakson aikana.

Kaikki potilaat jaettiin satunnaisesti kolikonheitolla ikää vastaaviin NSPT- ja OHE-ryhmiin. Tutkija 1 seuloi ja rekisteröi osallistujat ja jakoi heidät ikäryhmiin. Tutkija 2 suoritti satunnaisen jakosekvenssin käyttämällä kolikonheittomenetelmää osallistujien määrittämiseksi eri interventioihin, kun taas tutkija 1 suoritti kaikki interventiot. Osallistujia tai tutkinnon vastaanottajia ei sokaistettu.

Koska tutkimukseen osallistui vain yksi tutkija, tutkijan sisäinen luotettavuusarviointi suoritettiin sen varmistamiseksi, että tutkijan kyky toistaa jatkuvasti käytettyjen kliinisten parametrien kvantitatiivisia tulosmittauksia. Plakkiindeksi (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) ja Probing Attachment Loss (PAL) mitattiin noin 3 tunnin aikavälillä. Kappa-tilastoja käyttämällä saatiin hyvät sopimukset (>0,8) kaikkien tallennettujen kliinisten parametrien toistettavuudesta.

Kaikille rekrytoiduille potilaille tehtiin täydellinen periodontaalinen arviointi lähtötilanteessa, 2 kuukautta määrätyn hoidon jälkeen ja 3 kuukautta määrätyn hoidon jälkeen. Kliiniseen tutkimukseen sisältyi plakkiindeksi (PI), Gingival Bleeding Index (GBI), Probing Pocket Depth (PPD) ja Probing Attachment Loss (PAL) mitattiin elektronisella vakiovoima-anturilla (Florida Probe®).

Kaikille potilaille opastettiin suuhygieniamenetelmiä käyttäen pehmeäharjaista hammasharjaa, kompaktihammasharjaa, hammasväliharjoja ja hammaslankaa modifioitua Bass-tekniikkaa käyttäen. Täysi suupuhdistus, joka sisälsi hilseilyn ja juurien höyläyksen, tehtiin yhdellä käynnillä kaikille NSPT-ryhmän koehenkilöille käyttämällä ultraäänikiveä ja Gracey-kyreettejä. Lisäksi kaikille NSPT-ryhmän potilaille annettiin 0,12-prosenttista klooriheksidiiniä sisältävää suuvettä (Hexipro®). Heitä neuvottiin huuhtelemaan kolme kertaa päivässä käyttäen 15 ml:aa joka kerta 14 päivän ajan, joka alkoi välittömästi koko suun puhdistamisen jälkeen. Sen jälkeen jokaisella palautuskäynnillä kaikki osallistujat motivoitiin uudelleen ja testiryhmään kuuluville suoritettiin ammattimainen profylaksi.

Jokaiselta potilaalta kerättiin 15 ml laskimoverta lähtötilanteessa, ennen hoitoa ja 3 kuukautta määrättyjen hoitojen jälkeen. Glykosyloidun hemoglobiinin (HbA1c) ja systeemisen hs-C-reaktiivisen proteiinin (hs-CRP) tasot arvioitiin. Hs-CRP-tasot arvioitiin käyttämällä testejä korkean herkkyyden CRP:lle (hs-CRP). Kaikki veritutkimukset tehtiin yksityisessä laboratoriossa (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) ilman yhteyttä parodontologian laitokseen. HbA1c-testaus on DCCT-linjattu ja laboratorion laadunvarmistus on Bio-Rad Laboratoriesin (USA) ja EQAS:n (External Quality Assurance Services) sertifioitu.

Syvimmät taskut tunnistettiin (vähintään 5 taskua, joiden PPD ≥ 5 mm) ja eristettiin puuvillarullilla. Tätä seurasi supragingivaalisen plakin huolellinen poistaminen puuvillapelleteillä ja kyreteillä. Subgingivaaliset plakkinäytteet kerättiin sen jälkeen steriileillä kyreteillä ja yhdistettiin steriiliin DNAaasi- ja RNaasi-vapaaseen polyeteeniputkeen, joka sisälsi 1 ml fosfaattipuskuriliuosta (PBS), ja jäädytettiin -800 °C:ssa q-PCR-analyysin aloittamiseen asti.

Automatisoitu DNA-uutto suoritettiin laboratoriossa käyttämällä QIAcube-konetta (Qiagen®). 100 ui plakkinäytettä laitettiin 1,5 ml:n sentrifugiputkeen ja sentrifugoitiin nopeudella 5 000 x g 10 minuuttia pöytäsentrifugikoneessa, jolloin saatiin pelletti. Sitten pelletit asetettiin QIAcube-ravistimeen automaattista DNA:n uuttamista varten QIAcube-koneella käyttämällä DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit -sarjaa ja QIAmp® DNA -lisävarustesarjaa. Kaikki pakkauksessa olevat reagenssit asetettiin manuaalisesti koneen reagenssipullotelineeseen ennen prosessin aloittamista. Lopuksi "Bacterial DNA" -protokolla valittiin koneen protokollaluettelosta. Lyhyesti, Qiacube-kone kävi läpi viisi peräkkäistä vaihetta, jotka sisälsivät lyysi-, inkubointi-, sitomis-, pesu- ja eluointiprosessit. Prosessin lopussa oli saatavilla 100 ui eluoitua DNA:ta. Uutetun DNA:n pitoisuus ja puhtaus testattiin sitten Nanodrop-koneella. Sitten DNA säilytettiin -80 °C:ssa ennen bakteerien tunnistamista q-PCR-koneella.

Uutetun DNA:n pitoisuus ja puhtaus määritettiin käyttämällä spektrofotometrilaitetta (Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometers), joka oli yhdistetty PC-pohjaiseen ohjelmistoon. 0,1 ui eluoitua DNA:ta pipetoitiin alempaan jalustan varteen. Kuituoptinen kaapeli (vastaanottokuitu) on upotettu tähän jalustaan. Toinen kuituoptinen kaapeli (lähdekuitu), joka sijaitsee ylemmässä jalustan varressa, saatetaan sitten kosketukseen nestenäytteen kanssa, jolloin neste muodostaa sillan kahden kuidun päiden välisen raon. Pulssitoiminen xenon-salamalamppu toimii valonlähteenä ja lineaarista CCD-ryhmää hyödyntävä spektrometri analysoi näytteen läpi kulkevan valon. DNA-konsentraatio sekä plakkinäytteistä että vertailukannasta mitattiin ja kirjattiin sen mukaisesti. Uutetut DNA:t säilytettiin lopulta -20 °C:ssa q-PCR-menettelyn aloittamiseen asti.

P. gingivalisin, A.actinomycetemcomitansin, P.intermedian ja T.forsythian havaitseminen ja kvantifiointi plakkinäytteistä tehtiin käyttämällä Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems -järjestelmää, joka oli kytketty PC-pohjaiseen ohjelmistoon. Kvantitointi tehtiin projisoimalla näytteiden syklin kynnysarvo (Ct) bakteerireferenssikannan tunnetun määrän (pitoisuuden) standardikäyrään.

Tätä tarkoitusta varten tunnettu määrä bakteerien uutettua DNA:ta laimennettiin sarjassa (10-kertainen laimennus) ja sille suoritettiin RT-PCR-monistus. Tämä tehtiin standardikäyrän saamiseksi ennen DNA:n monistamista plakkinäytteistä käyttämällä q-PCR:ää. Optimointi suoritettiin optimaalisen standardikäyrän saamiseksi kvantifiointia varten. Kvantitoinnin perustana käytettiin vertailukantojen lopullista 10-kertaista laimennusstandardikäyrää (alue 10 ng/µl - 0,0001 ng/µl), joiden R2-arvo oli 0,956.

q-PCR-tekniikan herkkyyden määrittämiseksi q-PCR-analyysiä varten käsiteltiin sarjanäytteitä, jotka sisälsivät tunnettuja pitoisuuksia yksittäisiä mikro-organismeja. Pienin pitoisuus, joka johti positiiviseen PCR-tuotteeseen, katsottiin määrityksen herkkyydeksi.

q-PCR-monistus tehtiin 20 ui:n kokonaisreaktioseoksen tilavuudessa. Tämä seos sisälsi 2 µl puhdistettua DNA:ta plakkinäytteestä/vertailukannasta toimimaan PCR-templaattina, 10 µl 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mixiä (PCR-puskuri, dNTP:t, Amplitaq Gold, vertailusignaali, urasiili-N-glykosylaasi, MgCl2; Applied Bio järjestelmät, Foster City, CA, USA), 1 µl Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x) ja 7 µl nukleaasivapaata vettä. Menettelyt suoritettiin käyttämällä 96-kuoppaisia ​​reaktiolevyjä.

Kaikki reaktioseoksen komponentit (paitsi DNA-näytettä) lisättiin 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkeen. Putki suljettiin ja sitä vorteksoitiin lyhyesti. Sitten putket sentrifugoitiin sisällön pyörittämiseksi alas ja ilmakuplien poistamiseksi. Seos siirrettiin sitten 96-kuoppaiselle reaktiolevylle ja sen jälkeen lisättiin 2 ui DNA-näytettä. Reaktiolevy peitettiin sitten optisella liimakerroksella, kun koko kuoppa oli täytetty. Tätä reaktiolevyä sentrifugoitiin jälleen lyhyesti sen sisällön pyörittämiseksi alaspäin ja kaikkien kuplien poistamiseksi.

Tälle seokselle suoritettiin sitten alkuperäinen monistussykli 50 ºC:ssa 2 minuutin ajan ja 95 ºC:ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen seurasi 45 sykliä 95 ºC:ssa 15 sekunnin ajan ja 60 ºC:ssa 1 minuutin ajan. Jokaisen näytteen q-PCR-amplifikaatiokäyrä analysoitiin Ct-arvon määrittämiseksi. Ct-arvo projisoitiin sitten vertailukannan standardikäyrään kvantifiointia varten.

PI:n, GBI:n, PPD:n (%) ja PAL:n (%) muutosten vertailut sekä ryhmien sisällä että niiden välillä suoritettiin khin neliötestillä. Keskimääräisen PPD:n, keskimääräisen PAL:n, keskimääräisen HbA1c:n, keskimääräisen CRP:n ja P. gingivalisin, A.actinomycetemcomitansin, P.intermedian ja T.forsythian havaitsemistiheyden ryhmien välinen vertailu arvioitiin parinäytteen t-testillä, kun taas ryhmien väliset vertailut samoilla muuttujilla suoritettiin käyttämällä riippumatonta näyte-t-testiä.