La interrelación entre la enfermedad periodontal y la diabetes mellitus entre los adultos de Malasia

Se obtuvo la aprobación ética de las Juntas de Ética Médica del Centro Médico de la Universidad de Malaya (MEC Ref No: 696.9) y del Centro Dental de la Universidad de Malaya [DF PE1002/0045(P)]. Ciento doce pacientes diabéticos tipo 2 (diagnosticados al menos 1 año antes del estudio) entre las edades de 30 a 70 años fueron evaluados de la Clínica de Diabetes para pacientes ambulatorios del Centro Médico de la Universidad de Malaya y un total de 40 pacientes que cumplieron con los requisitos de inclusión y exclusión. criterios fueron reclutados para el estudio. Los pacientes reclutados luego se registraron en la Clínica de Periodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad de Malaya. A todos los pacientes se les entregaron hojas de información sobre el estudio y explicaciones verbales. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes reclutados con el entendimiento de que podían retirarse del estudio en cualquier momento. La detección y el tratamiento de los pacientes comenzaron desde enero de 2010 hasta diciembre de 2011.

El cálculo del tamaño de la muestra determinó que 15 sujetos por grupo de tratamiento proporcionarían un poder del 80 % para detectar una diferencia mínima del 1 % (11,0 mmol/mol) de cambio en la HbA1c entre la prueba y el control. En consecuencia, se reclutó una muestra de 20 sujetos por brazo (40 en total) para compensar posibles abandonos durante el período de estudio.

Todos los pacientes fueron asignados aleatoriamente a través de un lanzamiento de moneda a los grupos NSPT y OHE de la misma edad. El investigador 1 seleccionó e inscribió a los participantes y los asignó a grupos de la misma edad. El investigador 2 realizó la secuencia de asignación aleatoria utilizando el método de lanzamiento de una moneda para asignar a los participantes a las diferentes intervenciones, mientras que el investigador 1 realizó todas las intervenciones. No hubo cegamiento de los participantes ni del examinador.

Como solo un examinador participó en el estudio, se ejecutó una evaluación de la confiabilidad intraexaminador para validar la capacidad del examinador de reproducir constantemente las medidas de resultado cuantitativas de los parámetros clínicos utilizados. El índice de placa (PI), el índice de sangrado gingival (GBI), la profundidad de la bolsa de sondaje (PPD) y la pérdida de unión al sondaje (PAL) se midieron en un intervalo de tiempo de aproximadamente 3 horas. Utilizando las estadísticas de Kappa, se obtuvieron buenas concordancias (>0,8) para la reproducibilidad de todos los parámetros clínicos registrados.

Todos los pacientes reclutados se sometieron a una evaluación periodontal completa al inicio del estudio, 2 meses después del tratamiento asignado y 3 meses después del tratamiento asignado. El examen clínico incluyó el índice de placa (PI), el índice de sangrado gingival (GBI), la profundidad de la bolsa de sondaje (PPD) y la pérdida de inserción al sondaje (PAL) medidos con una sonda electrónica de fuerza constante (Florida Probe®).

Todos los pacientes fueron instruidos en los métodos de higiene oral utilizando un cepillo de dientes de cerdas suaves, un cepillo de dientes compacto, cepillos interdentales e hilo dental utilizando la técnica de Bass modificada. El desbridamiento bucal completo, que consistió en raspado y alisado radicular, se realizó en una sola visita para todos los sujetos del grupo NSPT utilizando un raspador ultrasónico y curetas Gracey. Además, a todos los pacientes del grupo NSPT se les administró un enjuague bucal con clorhexidina al 0,12 % (Hexipro®). Se les indicó que se enjuagaran tres veces al día usando 15 ml cada vez durante un período de 14 días que comenzó inmediatamente después de completar el desbridamiento bucal completo. A partir de entonces, en cada visita de revisión, se volvió a motivar a todos los participantes y se realizó una profilaxis profesional en los del grupo de prueba.

Se recogieron 15 ml de sangre venosa de cada paciente al inicio, antes del tratamiento y 3 meses después de los tratamientos asignados. Se evaluaron los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c) y proteína reactiva hs-C sistémica (hs-CRP). Los niveles de PCR-hs se evaluaron mediante pruebas de PCR de alta sensibilidad (PCR-hs). Todas las investigaciones de sangre se realizaron en un laboratorio privado (Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) sin adscripción al Departamento de Periodoncia. La prueba de HbA1c está alineada con DCCT y la Garantía de calidad del laboratorio está certificada por Bio-Rad Laboratories (EE. UU.), EQAS (Servicios de garantía de calidad externa).

Se identificaron las bolsas más profundas (mínimo 5 bolsas con PPD ≥ 5 mm) y se aislaron con rollos de algodón. A esto le siguió una eliminación cuidadosa de la placa supragingival usando bolitas de algodón y curetas. Las muestras de placa subgingival se recogieron posteriormente con curetas estériles y se agruparon en un tubo de polietileno estéril libre de ADNasa y ARNasa que contenía 1 ml de solución tampón de fosfato (PBS) y se congeló a -800C hasta el comienzo del análisis q-PCR.

La extracción de ADN automatizada se realizó en el laboratorio utilizando la máquina QIAcube (Qiagen®). Se colocaron 100 µl de muestra de placa en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y se centrifugaron a una velocidad de 5000 × g durante 10 minutos en una máquina centrífuga de mesa para obtener un sedimento. A continuación, los gránulos se colocaron en el agitador QIAcube para la extracción automatizada de ADN mediante la máquina QIAcube utilizando el kit DNeasy® Blood & Tissue Mini y el juego de accesorios QIAmp® DNA. Todos los reactivos proporcionados en el kit se colocaron manualmente en la gradilla de botellas de reactivos de la máquina antes del inicio del proceso. Finalmente, se seleccionó el protocolo "ADN bacteriano" de la lista de protocolos de la máquina. Brevemente, la máquina Qiacube se sometió a cinco pasos consecutivos que incluyeron procesos de lisis, incubación, unión, lavado y elución. Al final del proceso, estaban disponibles 100 µl de ADN eluido. Luego, se analizó la concentración y la pureza del ADN extraído utilizando la máquina Nanodrop. Luego, el ADN se almacenó a -80 ⁰C antes de la identificación bacteriana usando una máquina q-PCR.

La concentración y la pureza del ADN extraído se determinaron utilizando la máquina de espectrofotómetro (espectrofotómetros Thermo Scientific NanoDrop™ 2000) que se conectó con un software basado en PC. Se pipetearon 0,1 µl de ADN eluido en el brazo del pedestal inferior. Un cable de fibra óptica (la fibra receptora) está incrustado dentro de este pedestal. Luego, un segundo cable de fibra óptica (la fibra fuente) ubicado en el brazo del pedestal superior se pone en contacto con la muestra líquida, lo que hace que el líquido cubra el espacio entre los extremos de las dos fibras. Una lámpara de flash de xenón pulsada proporciona la fuente de luz y un espectrómetro que utiliza una matriz CCD lineal analiza la luz que pasa a través de la muestra. La concentración de ADN tanto de las muestras de placa como de la cepa de referencia se midió y registró en consecuencia. Los ADN extraídos finalmente se almacenaron a -20 ⁰C hasta el comienzo del procedimiento de q-PCR.

La detección y cuantificación de P. gingivalis, A.actinomycetemcomitans, P.intermedia y T.forsythia a partir de muestras de placa se realizaron con Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR Systems que se conectó a un software basado en PC. La cuantificación se realizó proyectando el valor del umbral de ciclo (Ct) de las muestras en la curva estándar de la cantidad conocida (concentración) de la cepa bacteriana de referencia.

Para este propósito, una cantidad conocida de ADN extraído de las bacterias se diluyó en serie (dilución de 10 veces) y se sometió a amplificación por RT-PCR. Esto se hizo para proporcionar una curva estándar antes de la amplificación del ADN de las muestras de placa mediante q-PCR. La optimización se llevó a cabo con el fin de obtener la curva estándar óptima para la cuantificación. Se utilizó como base para la cuantificación una curva estándar final de dilución de 10 veces de las cepas de referencia (rango de 10 ng/µl a 0,0001 ng/µl) con un valor R2 de 0,956.

Para determinar la sensibilidad de la técnica de q-PCR, se procesaron muestras en serie que contenían concentraciones conocidas de microorganismos individuales para el análisis de q-PCR. La concentración más baja que dio como resultado un producto de PCR positivo se consideró como la sensibilidad del ensayo.

La amplificación por q-PCR se realizó en un volumen total de mezcla de reacción de 20 µl. Esta mezcla contenía 2 µl de ADN purificado de muestra de placa/cepa de referencia para actuar como plantilla de PCR, 10 µl de 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix (tampón de PCR, dNTP, Amplitaq Gold, señal de referencia, uracilo N-glicosilasa, MgCl2; Applied Bio system, Foster City, CA, EE. UU.), 1 µl de ensayo de expresión génica Custom Taqman® (20x) y 7 µl de agua libre de nucleasas. Los procedimientos se realizaron utilizando placas de reacción de 96 pocillos.

Todos los componentes de la mezcla de reacción (excepto la muestra de ADN) se añadieron a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El tubo se tapó y se agitó brevemente. Luego, los tubos se centrifugaron para reducir el contenido y eliminar las burbujas de aire. A continuación, la mezcla se transfirió a una placa de reacción de 96 pocillos y se añadió 2 µl de muestra de ADN. A continuación, la placa de reacción se cubrió con una cubierta de adhesivo óptico después de haber ocupado todo el pocillo. Esta placa de reacción se volvió a centrifugar brevemente para reducir el contenido y asegurar que se eliminaran todas las burbujas.

A continuación, esta mezcla se sometió a un ciclo de amplificación inicial de 50 ºC durante 2 minutos y 95 ºC durante 10 minutos, seguido de 45 ciclos a 95 ºC durante 15 s y 60 ºC durante 1 minuto. Se analizó el gráfico de amplificación de q-PCR para cada muestra para determinar el valor de Ct. Luego, el valor de Ct se proyectó a la curva estándar de la cepa de referencia para la cuantificación.

Las comparaciones de cambios en PI, GBI, PPD (%) y PAL (%) tanto dentro como entre los grupos se realizaron mediante la prueba de chi-cuadrado. La comparación intragrupo para la PPD media, la PAL media, la HbA1c media, la PCR media y la frecuencia de detección de P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, P. intermedia y T. forsythia se evaluaron con la prueba t de muestras pareadas, mientras que las comparaciones entre grupos para las mismas variables se logró usando una prueba t de muestra independiente.