成年马来西亚人的牙周病和糖尿病的相互关系

马来亚大学医学中心 (MEC Ref No: 696.9) 和马来亚大学牙科中心 [DF PE1002/0045(P)] 的医学伦理委员会获得了伦理批准。 从马来亚大学医学中心糖尿病门诊筛选了112名年龄在30至70岁之间的2型糖尿病患者（至少在研究前1年诊断），共有40名患者符合纳入和排除为这项研究招募了标准。 招募的患者随后在马来亚大学牙科学院的牙周病诊所登记。 向所有患者提供有关研究和口头解释的患者信息表。 所有招募的患者都获得了知情同意，并了解他们可以随时退出研究。 患者的筛查和治疗从 2010 年 1 月开始至 2011 年 12 月。

样本量计算确定每个治疗组 15 名受试者将提供 80% 的功效来检测测试和对照之间 HbA1c 变化的最小差异 1% (11.0 mmol/mol)。 因此，每组招募 20 名受试者（总共 40 名）作为样本，以补偿研究期间可能退出的人数。

通过掷硬币将所有患者随机分配到年龄匹配的 NSPT 和 OHE 组。 研究者 1 筛选并招募参与者，并将他们分配到年龄匹配的组。 调查员 2 使用掷硬币方法执行随机分配序列，将参与者分配到不同的干预措施，而调查员 1 执行所有干预措施。 没有对参与者或检查者设盲。

由于只有一名考官参与了这项研究，因此执行考官内部可靠性评估以验证考官不断重现所用临床参数的定量结果测量的能力。 以约 3 小时的时间间隔测量菌斑指数 (PI)、牙龈出血指数 (GBI)、探诊袋深度 (PPD) 和探诊附着损失 (PAL)。 利用 Kappa 统计，所有记录的临床参数的可重复性都获得了良好的一致性 (>0.8)。

所有招募的患者在基线、指定治疗后 2 个月和指定治疗后 3 个月接受了全面的牙周评估。 临床检查包括牙菌斑指数 (PI)、牙龈出血指数 (GBI)、探诊袋深度 (PPD) 和用电子恒力探头 (Florida Probe®) 测量的探诊附着损失 (PAL)。

所有患者都接受了使用软毛牙刷、紧凑型牙刷、齿间刷和使用改良 Bass 技术的牙线的口腔卫生方法指导。 全口清创术包括刮治和根面平整，使用超声波洁治器和 Gracey 刮匙在 NSPT 组的所有受试者的单次就诊中完成。 此外，NSPT 组的所有患者都接受了 0.12% 洗必泰漱口水 (Hexipro®)。 他们被指示每天冲洗 3 次，每次使用 15 毫升，持续 14 天，从完成全口清创后立即开始。 此后，在每次回访时，所有参与者都被重新激励，并对测试组的参与者进行了专业预防。

在基线、治疗前和指定治疗后 3 个月时，从每位患者采集 15 毫升静脉血。 评估了糖化血红蛋白 (HbA1c) 和全身 hs-C 反应蛋白 (hs-CRP) 的水平。 使用高灵敏度 CRP (hs-CRP) 测试评估 hs-CRP 水平。 所有血液检查均在私人实验室（Gnosis Laboratories Sdn. Bhd) 与牙周病学系没有隶属关系。 HbA1c 测试符合 DCCT 标准，实验室的质量保证已通过 Bio-Rad 实验室（美国）、EQAS（外部质量保证服务）认证。

确定最深的口袋（至少 5 个 PPD ≥ 5 毫米的口袋）并用棉卷隔离。 随后使用棉球和刮匙小心去除龈上菌斑。 随后使用无菌刮匙收集龈下菌斑样品，并汇集到含有 1ml 磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 的无菌无 DNAse 和无 RNase 的聚乙烯管中，并在 -800C 下冷冻直至开始 q-PCR 分析。

使用 QIAcube 机器 (Qiagen®) 在实验室中进行自动 DNA 提取。 取 100 μl 噬菌斑样品置于 1.5 ml 离心管中，在台式离心机上以 5,000×g 的速度离心 10 分钟，得到沉淀。 然后将沉淀置于 QIAcube 振荡器上，通过 QIAcube 机器使用 DNeasy® Blood & Tissue Mini Kit 和 QIAmp® DNA accessory set 进行自动 DNA 提取。 在该过程开始之前，试剂盒中提供的所有试剂都被手动放入机器中的试剂瓶架中。 最后，从机器的协议列表中选择“细菌 DNA”协议。 简而言之，Qiacube 机器经历了五个连续步骤，包括裂解、孵育、结合、洗涤和洗脱过程。 在该过程结束时，可获得 100µl 洗脱的 DNA。 然后使用 Nanodrop 机器测试提取的 DNA 的浓度和纯度。 然后将 DNA 储存在 -80⁰C 中，然后使用 q-PCR 机器进行细菌鉴定。

使用与基于 PC 的软件连接的分光光度计（Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 分光光度计）测定提取的 DNA 的浓度和纯度。 将 0.1 µl 洗脱的 DNA 吸移到下基座臂上。 光纤电缆（接收光纤）嵌入该基座内。 然后将位于上基座臂中的第二根光纤电缆（源光纤）与液体样品接触，使液体桥接两条光纤末端之间的间隙。 脉冲氙闪光灯提供光源，利用线性 CCD 阵列的光谱仪分析穿过样品的光。 相应地测量并记录了来自噬菌斑样品和参考菌株的 DNA 浓度。 提取的 DNA 最终储存在 -20⁰C 中，直到 q-PCR 程序开始。

使用连接到基于 PC 的软件的 Applied Biosystems® 7500 实时 PCR 系统对牙菌斑样品中的 P. gingivalis、A.actinomycetemcomitans、P.intermedia 和 T.forsythia 进行检测和定量。 通过将样品的循环阈值 (Ct) 投影到已知数量（浓度）的细菌参考菌株的标准曲线上来进行量化。

为此，将已知量的细菌提取 DNA 连续稀释（10 倍稀释）并进行 RT-PCR 扩增。 这样做是为了在使用 q-PCR 从斑块样本中扩增 DNA 之前提供标准曲线。 进行优化以获得最佳的定量标准曲线。 使用 R2 值为 0.956 的参考菌株（范围为 10ng/µl-0.0001 ng/µl）的最终 10 倍稀释标准曲线作为定量基础。

为了确定 q-PCR 技术的灵敏度，对含有已知浓度的单个微生物的系列样品进行处理以进行 q-PCR 分析。 导致阳性 PCR 产物的最低浓度被认为是测定的灵敏度。

在 20µl 的总反应混合物体积中进行 q-PCR 扩增。 该混合物包含 2 微升来自斑块样本/参考菌株的纯化 DNA，用作 PCR 模板，10 微升 2x TaqMan® Fast Advanced Master Mix（PCR 缓冲液、dNTP、Amplitaq Gold、参考信号、尿嘧啶 N-糖基化酶、MgCl2；Applied Bio systems, Foster City, CA, USA)，1µl Custom Taqman® Gene Expression Assay (20x) 和 7µl 无核酸酶水。 该程序使用 96 孔反应板进行。

将反应混合物的所有组分（DNA 样品除外）加入到 1.5mL 微量离心管中。 将管盖上盖子并短暂涡旋。 然后将管离心以旋转内容物并消除气泡。 然后将混合物转移到 96 孔反应板中，然后加入 2μl DNA 样品。 在整个孔被占据后，反应板被光学粘合剂盖覆盖。 再次对该反应板进行短暂离心以将内容物旋转下来并确保消除所有气泡。

然后将该混合物进行 50ºC 2 分钟和 95ºC 10 分钟的初始扩增循环，然后在 95ºC 15 秒和 60ºC 1 分钟下进行 45 个循环。 分析每个样品的 q-PCR 扩增图以确定 Ct 值。 然后将 Ct 值投影到参考应变的标准曲线以进行量化。

使用卡方检验对组内和组间的 PI、GBI、PPD(%) 和 PAL(%) 的变化进行比较。 使用配对样本 t 检验评估平均 PPD、平均 PAL、平均 HbA1c、平均 CRP 和 P. gingivalis、A.actinomycetemcomitans、P.intermedia 和 T.forsythia 的组内比较，而相同变量的组间比较使用独立样本 t 检验完成。