인간 심근의 원격 허혈성 전처리

조사관은 다음을 연구합니다.

1. 기능적 장기 목욕 모델에서 모의 ​​저산소증/재관류에 대한 고립된 우심방 펙티네이트 근육 섬유주의 저항
2. 시뮬레이션된 저산소증/재관류에 의한 세포사멸 유도에 대한 분리된 우심방 펙티네이트 근육 섬유주의 저항
3. 시뮬레이션된 저산소증/재관류에 의해 유도된 변화에 대한 분리된 우심방 펙티네이트 근육 섬유주에서 미토콘드리아의 저항

동시에 우리는 다음을 평가할 것입니다:

1. 수술 후 심근 괴사 마커 방출 프로필에 의해 평가된 관상 동맥 우회술(CABG) 동안 허혈 및 재관류 기간에 의해 유도된 생체 내 심근 괴사의 양
2. 혈역학 측정(열조절 방법), 산소 공급/소비 및 수축성 지원 요구 사항에 의해 평가된 CABG 동안 허혈 및 재관류 기간 후 생체 내 심근 기능
3. 좌심실 심근 생검에서 평가된 CABG 동안 허혈 및 재관류 기간 후 아폽토시스 및 미토콘드리아 상태의 유도 조사자는 동일한 환자로부터의 시험관내 및 생체내 소견의 상관관계를 시도할 것이다.

방법론 연구는 생체 내 및 생체 외 모두에서 수행됩니다. 안정적인 관상 동맥 질환에 대해 CABG에 의뢰된 환자를 모집하고 무작위 자릿수 생성기를 통해 두 그룹 중 하나로 무작위 배정(1:1)합니다: 원격 사전 조정 또는 "위약" 개입. 심폐우회술(CPB)을 사용하여 최소 3개의 관상동맥우회술 이식이 계획된 환자만 포함됩니다. 수술 당일 마취 유도 후 피부 절개 전 원격 전처리가 유도됩니다. "플라시보" 그룹은 오른쪽 팔에 압력 커프를 배치하지만 팽창은 수행하지 않습니다. 맹검을 얻기 위해 팽창은 외과용 커튼 아래에서 발생하며 무작위 시퀀스 생성 및 원격 사전 조정 응용 프로그램에 관여하지만 환자 관리 또는 기타 연구 관련이 아닌 동일한 사람에 의해 매번 수행됩니다. 작업.

동의한 모든 환자는 일상적인 수술 전 관리의 일환으로 수술 전 심초음파, 심전도 및 바보 혈구 수, 크레아티닌, BUN 및 간 기능 검사를 포함한 혈액 검사를 받게 됩니다. 추가로 트로포닌 T 및 CK-MB 수준이 평가될 것입니다. 또한 환자는 수술 후 1일째 심전도 검사를 시행하게 됩니다.

마취는 수술 1시간 전 midazolam 15mg, etomidate 0.2mg/kg, fentanyl 5g/kg, 마취유도를 위한 pancuronium 0.1mg/kg 정맥주사, propofol 0.5-1.0으로 표준화한다. 마취 유지를 위한 mg/kg/h 및 펜타닐 4g/kg/h 주입. 마취 가스는 사용되지 않습니다. 완전한 혈류역학 모니터링은 Swan-Ganz 카테터와 함께 사용됩니다(CABG 환자에서는 일상적이지 않음). 첫 번째 혈역학 측정 및 산소 공급/소비량 계산은 수술 전에 수행됩니다.

기능적 체외 평가. CPB에 대한 삽관 시, 정맥 캐뉼라 배치를 위해 일상적으로 제거되고 폐기되는 우심방 부속기를 모든 환자에서 채취합니다. 조직은 얼음처럼 차가운 Krebs-Henseleit 용액에서 우리 부서의 격리된 장기 연구실로 옮겨질 것입니다. 세포사멸 또는 미토콘드리아의 기준선 평가를 위해 하나의 펙티네이트 근육 섬유주를 수확할 것입니다(아래 참조). 직경이 1mm 미만인 또 다른 단일 섬유주를 오르간 챔버에 장착합니다. Schuler Organbath(Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Germany(HSE))에는 Krebs-Henseleit 용액이 들어 있습니다. 이것은 카보겐(산소 95%, 이산화탄소 5%)이 포함된 유리 프릿을 통해 산소화되고 37°C로 유지됩니다. 백금 필드 전극과 주어진 준비에 대한 임계값의 150% 전위를 사용하여 1Hz 50ms 정사각형 자극으로 섬유주를 구동합니다. 자극기 유형 215(HSE)가 사용됩니다. 수축력은 F30 isometric force transducer Type 372(HSE)로 측정됩니다. 신호는 TAM A PlagSYS 변환기 증폭기 모듈 Type705(HSE)로 향상되고 PowerLab/4SP 시스템 및 차트 소프트웨어(AD Instruments)를 사용하여 기록됩니다.

Trabecula는 Frank-Starling 관계에 따라 최적 장력의 90%까지 점진적으로 늘어나고 30분 동안 안정화 및 유실됩니다.

60분 허혈은 carbogen의 산소를 아르곤(95% 아르곤, 5% 이산화탄소)으로 대체하고 Krebs-Henseleit 용액을 포도당 또는 피루브산을 포함하지 않는 용액으로 대체하여 시뮬레이션됩니다. 재산소화 시 카르보겐이 다시 추가되고 조직 목욕 용액이 처음에 사용된 용액으로 교체됩니다. 조직을 여러 번 세척하고 15분마다 세척하면서 120분의 재산소화 기간 동안 방치합니다. 저산소증 재산소화의 이 기능적 모델은 [12-14] 이전에 우리 연구실에서 사용되었습니다. 산소를 아르곤으로 교체하면 조직욕 산소 분압이 475±52mmHg에서 51±1.8mmHg로 떨어집니다(p<0.001). [37-39]. 이는 아이소메트릭 수축력의 현저하고 빠른 감소를 동반합니다. 재산소화 동안 수축력은 처음에 돌아오고 다음에 우리는 재산소화 손상의 발달로 해석하는 근육 근수축의 느린 감소를 관찰합니다. 마지막으로 기절 테스트를 위해 10-4M 노르에피네프린((-)-Arterenol Bitartrate)을 사용합니다.

수축력은 지속적으로 기록됩니다. 수축성은 주어진 프렙에 대한 초기 수축력의 백분율로 표시됩니다. 조사자들은 최대 회복 수축력, 재산소화 30분 및 120분 후의 수축력 및 재산소화 종료 시 10-4M 노르에피네프린을 첨가하여 생성된 수축력을 비교할 것이다.

조사관은 또한 섬유주(trabecula)의 휴식 긴장의 증가로 정의되는 허혈성 수축 발달의 징후를 찾을 것입니다. 이러한 증가는 저산소증이 시작된 직후에 시작하여 전체 저산소증 기간 동안 꾸준히 지속됩니다. 조사관은 저산소증이 끝날 때, 즉 최대 구축 시에 휴식 장력(mN/mg 조직 질량)의 증가를 비교할 것입니다.

모든 측정, 특히 기능의 회복은 원격으로 전처리된 섬유주와 "위약" 환자 사이에서 비교될 것입니다.

하나는 기준선에서 수확되고 다른 하나는 기능적 실험(60분 저산소증 + 120분 재산소화)에 적용되는 동일한 부속기로부터의 2개의 심방 섬유주를 매번 다음에 대해 연구할 것입니다:

• 아폽토시스 유도 - 웨스턴 블롯으로 측정된 카스파제 3 및 절단된 카스파제 3, PARP 및 절단된 PARP 발현, 또는
• 아폽토시스 유도 - Caspase 3, 절단된 Caspase 3, PARP 및 절단된 PARP에 대한 TUNEL 및 면역조직화학 염색으로 평가, 또는
• 미토콘드리아 상태(전자현미경) 120명의 환자를 무작위로 추출할 계획이므로(아래 참조) 세포사멸 및 미토콘드리아 연구를 위한 자료는 Western Blot의 경우 60명의 환자(30:30), 면역조직화학의 경우 40명의 환자(20:20)에서 무작위로 선택됩니다. 및 TUNEL, 및 전자 현미경을 위한 20명의 환자(10:10).

웨스턴 블롯(2개의 섬유주, 기준선 및 저산소증/재산소화 후, 30명의 원격 전처리 및 30명의 "위약" 환자로부터).

웨스턴 블롯 면역검정을 위해 섬유주를 액체 질소 면역조직화학(20명의 원격 전처리 및 20명의 "위약" 환자로부터의 저산소증/재산소화 후, 기준선 및 저산소증/재산소화 후)에 배치할 것이다.

조직 섹션에서 카스파제 3, 절단된 카스파제 3, PARP 및 절단된 PARP 단백질의 발현은 면역조직화학적으로 검출될 것이다. Trabeculae는 10% 중성 완충 포르말린(인산 완충액)에서 하룻밤 동안 고정되고, 이후에 등급이 매겨진 알코올 용액을 통과하고, 자일렌에서 세 번 처리되고, 마지막으로 파라핀 블록에 삽입됩니다. 면역조직화학 반응의 문서화는 Nikon Eclipse E400 광학 현미경과 결합된 SSC-DC58AP 카메라(Sony)로 수행됩니다.

TUNEL(말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉 및 라벨링)(20명의 원격 전처리 및 20명의 "위약" 환자로부터의 저산소증/재산소화 후, 기준선 및 저산소증/재산소화 후 2개의 섬유주).

조직 절편은 각각 5분 동안 자일렌의 2가지 변화에서 파라핀을 제거하고 각각 3분 동안 100% 에탄올의 2가지 변화와 1분 동안 95% 에탄올의 2가지 변화로 수화됩니다. 면역조직화학 반응의 문서화는 Nikon Eclipse E400 광학 현미경과 결합된 SSC-DC58AP 카메라(Sony)로 수행됩니다.

전자현미경(2개의 섬유주, 기준선 및 저산소증/재산소화 후, 10명의 원격 전처리 환자 및 10명의 "위약" 환자).

Trabeculae는 2% glutaraldehyde가 포함된 cacodyl 버퍼에 배치됩니다. 미토콘드리아는 배율 x16000의 JEOL-JEM 100CX 투과 전자 현미경(JEOL Inc, Peabody, Mass)으로 현미경 사진을 찍을 것입니다. 다음에 전자 현미경 사진을 저장하고 미토콘드리아 크기와 구조를 Image ProPlus 소프트웨어(Media Scanalytics)를 사용하여 분석합니다.

생체 내 시험 수술은 숙련된 심장 외과 의사가 정상 체온에서 CPB를 사용하여 수행됩니다. 심근 보호를 위해 간헐적 온혈(37°C) 전행성 심정지(miniplegia)가 사용됩니다. 최소 3개의 관상동맥우회술이 필요한 환자만 모집하기 때문에 대동맥 교차 클램프 시간은 최소 30분이 소요될 것으로 예상합니다. 교차 클램프 제거 후 근위 문합은 측면 물림 클램프를 사용하여 수행됩니다. 환자는 CPB에서 젖을 떼고 지혈을 확보한 다음 흉관을 흉관으로 닫습니다. 가슴을 닫기 직전에 심첨 부위에서 좌심실 심근의 16G 바늘로 자른 생검을 시행합니다. 조사관은 교차 클램프 제거에서 생검을 얻기까지의 재관류 시간이 적어도 40분 동안 지속될 것으로 예상합니다. 정확한 허혈(교차 클램프) 시간 및 재관류 시간(생검을 얻을 때까지)을 측정합니다.

심근 생검은 심방 섬유주와 동일한 방식으로 수확 및 평가됩니다. 조사관은 무작위로 액체 질소에서 수확한 60개(30:30) 생검에서 웨스턴 블롯팅을 수행하고, 10% 중성 완충 포르말린에서 수확한 40개(20:20)에서 TUNEL을 포함한 면역조직화학을 수행하고, 2% 글루타르알데히드를 포함하는 카코딜 완충액. Caspase3, 절단된 Caspase 3, PARP, 절단된 PARP, TUNEL 및 미토콘드리아를 평가하는 방법은 위에 설명되어 있습니다.

수술 후 환자는 ICU로 이송되어 일상적인 치료를 받게 됩니다.

임상 관찰의 1차 종점은 심장 트로포닌 T의 수술 후 방출입니다.

조사관은 수술 전과 크로스 클램프 제거 후 72시간 후에 심장 트로포닌 T(전기화학발광 "ECLIA", Roche)의 혈청 농도를 측정할 것입니다. 동시에 크레아틴 키나제 동종효소 MB의 수준을 평가할 것입니다(효소 분석, Roche). 시간 경과에 따른 마커 수준의 곡선 아래 영역이 그룹 간에 비교됩니다.

심근 기능을 평가하기 위해 모든 환자는 수술 전에 폐동맥 카테터(Swan Ganz 카테터)를 삽입합니다. 동맥 및 혼합 정맥 가스 분석에 기반한 산소 대사 상태뿐만 아니라 전체 혈역학적 평가(열조절 방법)는 수술 전과 대동맥 교차 클램프 제거 후 다음 48시간에 수행됩니다.

심박수 측정과 별도로 왼쪽 및 오른쪽 심장 작업 지수를 계산합니다. 산소 전달 지수와 추출 비율이 계산됩니다. 젖산 수치도 측정됩니다. 조사관은 또한 소위 등방성 지수를 사용하여 같은 시점에서 등방성 지원의 필요성을 평가할 것입니다.

모든 환자는 수술 후 관리 루틴에 따라 수술 후 2일과 4일에 수술 후 심전도를 검사하고 추가로 수술 후 1일에 검사합니다. 유사하게 일상적인 수술 후 관리의 일부로 수행되는 다른 일상적인 수술 후 검사는 수술 후 과정의 차이를 찾기 위해 수행, 모니터링 및 사용됩니다. 여기에는 심장 초음파 검사와 크레아티닌(eGFR)이 포함됩니다.