Fjern iskæmisk prækonditionering af humant myokardium

Efterforskerne vil studere:

1. Modstand af isolerede højre atrielle pectinatmuskeltrabekler mod simuleret hypoxi/reperfusion i funktionel organbadmodel
2. Modstand af isolerede højre atriale pectinatmuskeltrabekler mod induktion af apoptose ved simuleret hypoxi/reperfusion
3. Resistens af mitokondrier i isolerede højre atriale pectinatmuskeltrabekler mod ændringer induceret af simuleret hypoxi/reperfusion

Samtidig vurderer vi:

1. Mængden af ​​myokardienekrose in vivo induceret af periode med iskæmi og reperfusion under koronararterie-bypasstransplantation (CABG) som vurderet ved postoperativ myokardienekrose-markørfrigivelsesprofil
2. Myokardiefunktion in vivo efter perioden med iskæmi og reperfusion under CABG som vurderet ved hæmodynamiske målinger (termodilutionsmetode), iltforsyning/-forbrug og inotropisk støttebehov
3. Induktion af apoptose og status af mitokondrier efter perioden med iskæmi og reperfusion under CABG som vurderet i venstre ventrikulære myokardiebiopsier. Forskerne vil forsøge at korrelere in vitro og in vivo fundene fra de samme patienter.

Metode Undersøgelsen vil blive udført både in vivo og ex-vivo. Patienter henvist til CABG for stabil koronararteriesygdom vil blive rekrutteret og randomiseret (1:1) ved hjælp af tilfældig ciffergenerator til en af ​​to grupper: fjernprækonditionering eller "placebo"-intervention. Kun patienter, hvor der er planlagt mindst 3 koronararterie-bypass-transplantater med brug af cardiopulmonary bypass (CPB), vil blive inkluderet. På operationsdagen, efter induktion af anæstesi og før hudsnittet vil fjernprækonditionering blive fremkaldt. "Placebo"-gruppen vil have trykmanchetten placeret på højre arm, men der vil ikke blive udført oppustninger. For at opnå blinding vil oppustningerne finde sted under kirurgiske gardiner og vil blive udført af den samme person hver gang, som vil være involveret i tilfældig sekvensgenerering og fjernprækonditionering, men ikke i pleje af patienten eller anden forskningsrelateret opgaver.

Alle patienter, der har givet samtykke, vil have præoperativ ekkokardiografi, elektrokardiografi og blodprøver, inklusive narreblodtælling, kreatinin, BUN og leverfunktionstest udført som en del af deres rutinepræoperative pleje. Derudover vil troponin T og CK-MB niveauer blive vurderet. Endvidere vil patienter have foretaget elektrokardiografi 1. dag efter operationen.

Anæstesi vil være standardiseret og bestå af midazolam 15mg oralt 1 time før operation, etomidat 0,2mg/kg, fentanyl 5g/kg og pancuronium 0,1mg/kg iv til anæstesi-induktion, propofol 0,5-1,0 mg/kg/time og fentanyl 4g/kg/time infusion til vedligeholdelse af anæstesi. Der vil ikke blive brugt anæstesigas. Fuld hæmodynamisk monitorering vil blive brugt med Swan-Ganz kateter (ikke rutine hos CABG patienter). Første hæmodynamiske målinger og iltforsyning/forbrugsberegninger vil blive udført præoperativt.

Funktionel in vitro vurdering. Ved kanylering for CPB vil højre atrielt vedhæng, som rutinemæssigt fjernes og kasseres til venøs kanyleplacering, blive høstet hos alle patienter. Vævet vil blive overført i iskold Krebs-Henseleit opløsning til det isolerede organlaboratorium i vores afdeling. Én pektinatmuskeltrabecula vil blive høstet til baseline vurdering af apoptose eller mitokondrier (se nedenfor). En anden enkelt trabecula mindre end 1 mm i diameter vil blive monteret i orgelkammeret - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Tyskland (HSE)) indeholdende Krebs-Henseleit-opløsning. Det vil blive iltet via glasfritte med carbogen (95% oxygen, 5% kuldioxid) og holdes ved 37°C. Trabeculaen vil blive drevet med 1Hz 50ms kvadratstimuli ved hjælp af platinfeltelektroder og potentialet på 150% af tærsklen for given præparation. Stimulatoren Type 215 (HSE) vil blive brugt. Kontraktionskraften vil blive målt med F30 isometrisk krafttransducer Type 372 (HSE). Signalet vil blive forbedret med TAM A PlagSYS transducer forstærker modul Type705 (HSE) og optaget ved hjælp af PowerLab/4SP system og kortsoftware (AD Instruments).

Trabeculaen strækkes gradvist til 90 % af optimal spænding i henhold til Frank-Starling forholdet og efterlades i 30 minutter med stabilisering og udvaskning.

60 min iskæmi vil blive simuleret ved at erstatte oxygen i carbogen med argon (95% argon, 5% kuldioxid) og erstatte Krebs-Henseleit-opløsning med en, der ikke indeholder glucose eller pyruvat. Ved reoxygenering vil carbogen blive tilsat igen, og vævsbadsopløsningen vil blive erstattet med en, der blev brugt til at begynde med. Vævet vil blive vasket flere gange og efterladt i 120 minutters reoxygeneringsperiode med udvaskning hvert 15. minut. Denne funktionelle model for hypoxi reoxygenation er blevet brugt i vores laboratorium før [12-14]. Udskiftning af ilt med argon resulterer i faldet i vævsbadets iltpartialtryk fra 475±52 mmHg til 51±1,8 mmHg (p<0,001) [37-39]. Det er ledsaget af betydelig og hurtig nedgang i isometrisk kontraktionskraft. Under reoxygenering vender sammentrækningskraften tilbage til at begynde med, og dernæst observerer vi langsom nedgang i muskelinotropisme, hvilket vi tolker som udvikling af reoxygeneringsskade. Til sidst vil vi bruge 10-4 M noradrenalin ((-)-Arterenol Bitartrat) til at teste for bedøvelse.

Sammentrækningskraften vil blive registreret løbende. Kontraktilitet vil blive udtrykt i procent af den indledende kontraktionskraft for givet præparat. Efterforskerne vil sammenligne den maksimale genvundne kontraktionskraft, kontraktionskraften efter 30 min og 120 min reoxygenering og kontraktionskraften frembragt ved at tilføje 10-4M noradrenalin ved afslutningen af ​​reoxygeneringen.

Forskerne vil også se efter tegn på udvikling af iskæmisk kontraktur defineret som en stigning i hvilespænding i trabecula. Denne stigning, hvis den er til stede, starter kort efter begyndelsen af ​​hypoxi og fortsætter støt gennem hele hypoxiperioden. Forskerne vil sammenligne stigningen i hvilespænding (i mN/mg vævsmasse) ved slutningen af ​​hypoxi, det vil sige på tidspunktet for maksimal kontraktur.

Alle målinger, og især genopretning af funktion, vil blive sammenlignet mellem trabekler fra fjernt prækonditionerede og "placebo"-patienter.

To atrielle trabekler fra det samme vedhæng, en høstet ved baseline, og en anden udsat for funktionelt eksperiment (60 min hypoxi + 120 min reoxygenation) vil blive undersøgt hver gang for:

• apoptose induktion - Caspase 3 og spaltet Caspase 3, PARP og spaltet PARP ekspression målt med Western-Blot, eller
• apoptose-induktion - vurderet med TUNEL og immunhistokemi farvning for Caspase 3, spaltet Caspase 3, PARP og spaltet PARP, eller
• mitokondriers tilstand (elektronmikroskopi) Da vi planlægger at randomisere 120 patienter (se nedenfor), vil materialet til apoptose- og mitokondrierundersøgelser blive tilfældigt taget fra 60 patienter (30:30) for Western Blot, 40 patienter (20:20) til immunhistokemi og TUNEL, og 20 patienter (10:10) til elektronmikroskopi.

Western Blot (2 trabeculae, baseline og efter hypoxi/reoxygenation, fra 30 fjernkonditionerede og 30 "placebo"-patienter).

Til Western Blot-immunoassay vil trabeklerne blive placeret i flydende nitrogen-immunhistokemi (2 trabekler, baseline og efter hypoxi/reoxygenering, fra 20 fjernt konditionerede og 20 "placebo"-patienter).

Ekspression af Caspase 3, spaltet Caspase 3, PARP og spaltede PARP-proteiner i vævssnit vil blive påvist immunhistokemisk. Trabeculae fikseres natten over i 10 % neutralpufret formalin (phosphatbuffer), derefter passeret gennem graderede alkoholopløsninger, behandlet tre gange i xylen og til sidst indlejret i paraffinblokke. Dokumentationen af ​​immunhistokemiske reaktioner vil blive udført med SSC-DC58AP kamera (Sony) koblet med Nikon Eclipse E400 optisk mikroskop.

TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick og mærkning) (2 trabeculae, baseline og efter hypoxi/reoxygenation, fra 20 fjernt konditionerede og 20 "placebo" patienter).

Vævssektioner vil blive afparaffineret i 2 skift af xylen i 5 minutter hver og hydreret med 2 skift af 100 % ethanol i 3 minutter hver og 95 % ethanol i 1 minut. Dokumentationen af ​​immunhistokemiske reaktioner vil blive udført med SSC-DC58AP kamera (Sony) koblet med Nikon Eclipse E400 optisk mikroskop.

Elektronmikroskopi (2 trabekler, baseline og efter hypoxi/reoxygenering, fra 10 fjernt prækonditionerede og 10 "placebo"-patienter).

Trabeculae vil blive placeret i cacodyl buffer med 2% glutaraldehyd. Mitokondrierne vil blive mikrograferet med JEOL-JEM 100CX transmissionselektronmikroskop (JEOL Inc, Peabody, Mass) med forstørrelse x16000. Elektronmikrofotografierne vil derefter blive gemt, og mitokondriernes størrelse og struktur vil blive analyseret ved hjælp af Image ProPlus-software (Media Scanalytics).

In vivo forsøget Operationen vil blive udført med brug af CPB ved normotermi af erfaren hjertekirurg. Intermitterende varmblods (37°C) antegrad kardioplegi (miniplegi) vil blive brugt til myokardiebeskyttelse. Da kun patienter, der kræver mindst 3 koronare bypass-transplantater, vil blive rekrutteret, forventer vi, at aorta-krydsklemmetiden varer mindst 30 minutter. Efter fjernelse af krydsklemme vil de proksimale anastomoser blive udført ved hjælp af sidebidende klemme. Patienten vil blive vænnet fra CPB, hæmostase vil blive sikret, og brystet vil blive lukket over brystrør. Lige før brystkassen lukkes, vil der blive udtaget en 16G-nålskær biopsi af det venstre ventrikulære myokardium fra apexområdet. Efterforskerne forventer, at reperfusionstiden fra fjernelse af krydsklemmen til opnåelse af biopsien varer mindst 40 minutter. Den nøjagtige iskæmi (krydsklemme) tid og reperfusionstid (indtil opnåelse af biopsien) vil blive målt.

Myokardiebiopsierne vil blive høstet og vurderet på samme måde som atrial trabecule. Efterforskerne vil tilfældigt udføre Western blotting i 60 (30:30) biopsier høstet på flydende nitrogen, immunhistokemi inklusive TUNEL i 40 (20:20) høstet på 10 % neutral bufret formalin, og elektronmikroskopi i 20 (10:10) høstet på cacodylbuffer med 2% glutaraldehyd. Metoderne til vurdering af Caspase3, spaltet Caspase 3, PARP, spaltet PARP, TUNEL og mitokondrier er blevet beskrevet ovenfor.

Efter operationen vil patienten blive overført til intensivafdeling og behandlet som rutinemæssigt.

Det primære endepunkt for klinisk observation vil være den postoperative frigivelse af hjertetroponin T.

Efterforskerne vil måle serumkoncentrationen af ​​hjerte-troponin T (elektrokemiluminescens "ECLIA", Roche) præoperativt og næste 72 timer efter fjernelse af krydsklemme. Samtidig vil niveauet af kreatinkinase-isoenzym MB blive vurderet (enzymatisk assay, Roche). Arealet under kurven for markørniveauet over tid vil blive sammenlignet mellem grupperne.

For at vurdere myokardiefunktionen vil alle patienter få indsat pulmonalarteriekateter (Swan Ganz kateter) præoperativt. Fuld hæmodynamisk vurdering (termodilutionsmetode) samt iltmetabolismestatus baseret på arteriel og blandet venøs gasanalyse vil blive udført præoperativt og næste 48 timer efter fjernelse af aorta krydsklemme.

Udover at måle hjerteindeks vil vi beregne venstre og højre hjertearbejdsindeks. Ilttilførselsindekset og ekstraktionsforholdet vil blive beregnet. Laktatniveauerne vil også blive målt. Efterforskerne vil også vurdere behovet for inotrop støtte på samme tidspunkter ved hjælp af såkaldt inotropisk indeks.

Alle patienter vil have postoperativt elektrokardiogram på dag 2 og 4 i henhold til postoperativ plejerutine og desuden på 1. dag efter operationen. Tilsvarende vil andre rutinemæssige postoperative test, der udføres som en del af den rutinemæssige postoperative pleje, blive udført, overvåget og brugt til at se efter forskellene i postoperativt forløb. Dette inkluderer ekkokardiografi samt kreatinin (eGFR).