Precondizionamento ischemico remoto del miocardio umano

Gli investigatori studieranno:

1. Resistenza delle trabecole del muscolo pettinato atriale destro isolate all'ipossia/riperfusione simulata nel modello di bagno d'organo funzionale
2. Resistenza delle trabecole isolate del muscolo pettinato atriale destro all'induzione dell'apoptosi mediante ipossia/riperfusione simulata
3. Resistenza dei mitocondri nelle trabecole isolate del muscolo pettinato atriale destro ai cambiamenti indotti dall'ipossia/riperfusione simulata

Contestualmente valuteremo:

1. Quantità di necrosi miocardica in vivo indotta dal periodo di ischemia e riperfusione durante l'innesto di bypass dell'arteria coronaria (CABG) come valutato dal profilo di rilascio dei marcatori di necrosi miocardica postoperatoria
2. Funzione miocardica in vivo dopo il periodo di ischemia e riperfusione durante CABG valutata mediante misurazioni emodinamiche (metodo della termodiluizione), apporto/consumo di ossigeno e requisiti di supporto inotropo
3. Induzione dell'apoptosi e stato dei mitocondri dopo il periodo di ischemia e riperfusione durante il CABG come valutato nelle biopsie del miocardio ventricolare sinistro I ricercatori cercheranno di correlare i risultati in vitro e in vivo degli stessi pazienti.

Metodologia Lo studio sarà condotto sia in vivo che ex-vivo. I pazienti inviati per CABG per malattia coronarica stabile saranno reclutati e randomizzati (1: 1) da un generatore di cifre casuali a uno dei due gruppi: precondizionamento remoto o intervento "placebo". Saranno inclusi solo i pazienti in cui sono pianificati almeno 3 innesti di bypass coronarico con l'uso di bypass cardiopolmonare (CPB). Il giorno dell'intervento, dopo l'induzione dell'anestesia e prima dell'incisione cutanea, verrà sollecitato il precondizionamento remoto. Il gruppo "placebo" avrà il bracciale a pressione posizionato sul braccio destro ma non verrà eseguito alcun gonfiaggio. Per ottenere l'accecamento, le insufflazioni avverranno sotto teli chirurgici e saranno eseguite ogni volta dalla stessa persona, che sarà coinvolta nella generazione di sequenze casuali e nell'applicazione di precondizionamento remoto, ma non nella cura del paziente o in altre ricerche correlate compiti.

Tutti i pazienti acconsentiti verranno sottoposti a ecocardiografia preoperatoria, elettrocardiografia ed esami del sangue tra cui emocromo, creatinina, azotemia e test di funzionalità epatica eseguiti come parte delle loro cure preoperatorie di routine. Inoltre saranno valutati i livelli di troponina T e CK-MB. Inoltre i pazienti avranno eseguito l'elettrocardiografia il 1 ° giorno dopo l'operazione.

L'anestesia sarà standardizzata e consisterà in midazolam 15 mg per via orale 1 ora prima dell'intervento chirurgico, etomidate 0,2 mg/kg, fentanil 5 g/kg e pancuronio 0,1 mg/kg iv per l'induzione dell'anestesia, propofol 0,5-1,0 mg/kg/h e fentanil 4 g/kg/h per infusione per il mantenimento dell'anestesia. Non verranno utilizzati gas anestetici. Il monitoraggio emodinamico completo verrà utilizzato con il catetere di Swan-Ganz (non di routine nei pazienti con CABG). Le prime misurazioni emodinamiche e i calcoli dell'apporto/consumo di ossigeno verranno eseguiti prima dell'intervento.

Valutazione funzionale in vitro. Sulla cannulazione per CPB, l'appendice atriale destra, che viene abitualmente rimossa e scartata per il posizionamento della cannula venosa, verrà raccolta in tutti i pazienti. Il tessuto sarà trasferito in una soluzione ghiacciata di Krebs-Henseleit al laboratorio di organi isolati nel nostro dipartimento. Una trabecola muscolare pettinata sarà raccolta per la valutazione di base dell'apoptosi o dei mitocondri (vedi sotto). Un'altra singola trabecola di diametro inferiore a 1 mm sarà montata nella camera dell'organo - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Germania (HSE)) contenente la soluzione di Krebs-Henseleit. Sarà ossigenato tramite fritta di vetro con carbogeno (95% ossigeno, 5% anidride carbonica) e mantenuto a 37°C. La trabecola sarà pilotata con stimoli quadrati di 1Hz 50ms usando elettrodi di campo di platino e il potenziale del 150% della soglia per una data preparazione. Verrà utilizzato lo stimolatore Tipo 215 (HSE). La forza di contrazione sarà misurata con il trasduttore di forza isometrica F30 Tipo 372 (HSE). Il segnale sarà potenziato con il modulo amplificatore trasduttore TAM A PlagSYS Type705 (HSE) e registrato utilizzando il sistema PowerLab/4SP e il software Chart (AD Instruments).

La trabecola sarà gradualmente allungata al 90% della tensione ottimale secondo la relazione di Frank-Starling e lasciata per 30 minuti di stabilizzazione e dilavamento.

L'ischemia di 60 minuti sarà simulata sostituendo l'ossigeno nel carbogeno con argon (95% argon, 5% anidride carbonica) e sostituendo la soluzione di Krebs-Henseleit con una soluzione priva di glucosio o piruvato. Alla riossigenazione il carbogeno verrà aggiunto nuovamente e la soluzione del bagno di tessuto verrà sostituita con quella usata inizialmente. Il tessuto verrà lavato più volte e lasciato per 120 minuti di riossigenazione con lavaggi ogni 15 minuti. Questo modello funzionale di riossigenazione dell'ipossia è stato utilizzato nel nostro laboratorio prima [12-14]. La sostituzione dell'ossigeno con l'argon provoca la caduta della pressione parziale dell'ossigeno del bagno tissutale da 475±52 mmHg a 51±1,8 mmHg (p<0,001) [37-39]. È accompagnato da un significativo e rapido declino della forza di contrazione isometrica. Durante la riossigenazione la forza di contrazione ritorna inizialmente e successivamente osserviamo un lento declino dell'inotropismo muscolare che interpretiamo come sviluppo della lesione da riossigenazione. Alla fine, useremo 10-4 M di norepinefrina ((-)-Arterenol Bitartrate) per testare lo stordimento.

La forza di contrazione verrà registrata continuamente. La contrattilità sarà espressa in percentuale della forza di contrazione iniziale per una data preparazione. Gli investigatori confronteranno la massima forza di contrazione recuperata, la forza di contrazione dopo 30 minuti e 120 minuti di riossigenazione e la forza di contrazione prodotta aggiungendo noradrenalina 10-4M alla fine della riossigenazione.

Gli investigatori cercheranno anche i segni dello sviluppo della contrattura ischemica definita come un aumento della tensione a riposo della trabecola. Questo aumento, se presente, inizia poco dopo l'inizio dell'ipossia e continua costantemente durante l'intero periodo di ipossia. Gli investigatori confronteranno l'aumento della tensione a riposo (in mN/mg di massa tissutale) alla fine dell'ipossia, cioè al momento della massima contrattura.

Tutte le misurazioni, e in particolare il recupero della funzione, saranno confrontate tra trabecole di pazienti precondizionati a distanza e pazienti "placebo".

Due trabecole atriali dalla stessa appendice, una raccolta al basale e un'altra sottoposta a esperimento funzionale (60 min di ipossia + 120 min di riossigenazione) saranno studiate ogni volta per:

• induzione dell'apoptosi - Espressione di Caspase 3 e Caspase 3 scissa, PARP e PARP scissa misurata con Western-Blot, o
• induzione dell'apoptosi - valutata con TUNEL e colorazione immunoistochimica per Caspase 3, Caspase 3 clivata, PARP e PARP clivata, o
• stato dei mitocondri (microscopia elettronica) Poiché prevediamo di randomizzare 120 pazienti (vedi sotto), il materiale per gli studi sull'apoptosi e sui mitocondri sarà prelevato casualmente da 60 pazienti (30:30) per Western Blot, 40 pazienti (20:20) per immunoistochimica e TUNEL, e 20 pazienti (10:10) per la microscopia elettronica.

Western Blot (2 trabecole, al basale e dopo ipossia/riossigenazione, da 30 pazienti precondizionati in remoto e 30 pazienti "placebo").

Per l'immunodosaggio Western Blot le trabecole saranno poste in immunoistochimica con azoto liquido (2 trabecole, basale e dopo ipossia/riossigenazione, da 20 pazienti precondizionati a distanza e 20 "placebo").

L'espressione delle proteine ​​Caspase 3, Caspase 3 scissa, PARP e PARP scissa nelle sezioni di tessuto sarà rilevata immunoistochimicamente. Le trabecole saranno fissate durante la notte in formalina tamponata neutra al 10% (tampone fosfato), successivamente passate attraverso soluzioni alcoliche graduate, trattate tre volte in xilene e infine incluse in blocchi di paraffina. La documentazione delle reazioni immunoistochimiche sarà eseguita con camera SSC-DC58AP (Sony) accoppiata con microscopio ottico Nikon Eclipse E400.

TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick and labeling) (2 trabecole, al basale e dopo ipossia/riossigenazione, da 20 pazienti precondizionati in remoto e 20 pazienti "placebo").

Le sezioni di tessuto saranno deparaffinate in 2 cambi di xilene per 5 minuti ciascuno e idratate con 2 cambi di 100% etanolo per 3 minuti ciascuno e 95% etanolo per 1 minuto. La documentazione delle reazioni immunoistochimiche sarà eseguita con camera SSC-DC58AP (Sony) accoppiata con microscopio ottico Nikon Eclipse E400.

Microscopia elettronica (2 trabecole, al basale e dopo ipossia/riossigenazione, da 10 pazienti precondizionati a distanza e 10 pazienti "placebo").

Le trabecole saranno poste in tampone cacodyl con glutaraldeide al 2%. I mitocondri saranno micrografati con il microscopio elettronico a trasmissione JEOL-JEM 100CX (JEOL Inc, Peabody, Mass) con ingrandimento x16000. Le micrografie elettroniche verranno successivamente salvate e le dimensioni e la struttura dei mitocondri saranno analizzate utilizzando il software Image ProPlus (Media Scanalytics).

La sperimentazione in vivo L'operazione sarà eseguita con l'uso di CPB in normotermia da un cardiochirurgo esperto. La cardioplegia anterograda (miniplegia) intermittente a sangue caldo (37°C) verrà utilizzata per la protezione del miocardio. Poiché verranno reclutati solo i pazienti che richiedono almeno 3 innesti di bypass coronarico, ci aspettiamo che il tempo di crossclamp aortico duri almeno 30 minuti. Dopo la rimozione del morsetto incrociato, le anastomosi prossimali verranno eseguite utilizzando il morsetto per morso laterale. Il paziente verrà svezzato dal CPB, l'emostasi sarà assicurata e il torace verrà chiuso sopra i tubi toracici. Appena prima di chiudere il torace verrà prelevata una biopsia con ago da 16G del miocardio ventricolare sinistro dall'area dell'apice. Gli investigatori si aspettano che il tempo di riperfusione dalla rimozione del morsetto incrociato all'ottenimento della biopsia duri almeno 40 minuti. Verranno misurati l'esatto tempo di ischemia (cross-clamp) e il tempo di riperfusione (fino all'ottenimento della biopsia).

Le biopsie miocardiche saranno raccolte e valutate allo stesso modo della trabecola atriale. Gli investigatori eseguiranno casualmente Western blotting in 60 (30:30) biopsie raccolte su azoto liquido, immunoistochimica incluso TUNEL in 40 (20:20) raccolte su formalina tamponata neutra al 10% e microscopia elettronica in 20 (10:10) raccolte su tampone cacodilico con glutaraldeide al 2%. I metodi di valutazione di Caspase3, Caspase 3 clivata, PARP, PARP clivata, TUNEL e mitocondri sono stati descritti sopra.

Dopo l'operazione il paziente verrà trasferito in terapia intensiva e trattato come da routine.

L'endpoint primario dell'osservazione clinica sarà il rilascio postoperatorio della troponina cardiaca T.

Gli investigatori misureranno la concentrazione sierica della troponina T cardiaca (elettrochemiluminescenza "ECLIA", Roche) prima dell'intervento e le successive 72 ore dalla rimozione del morsetto incrociato. Contemporaneamente verrà valutato il livello di creatina chinasi isoenzima MB (saggio enzimatico, Roche). L'area sotto la curva del livello del marcatore nel tempo verrà confrontata tra i gruppi.

Per valutare la funzione miocardica tutti i pazienti avranno un catetere dell'arteria polmonare (catetere di Swan Ganz) inserito prima dell'intervento. La valutazione emodinamica completa (metodo della termodiluizione) e lo stato del metabolismo dell'ossigeno basato sull'analisi dei gas venosi arteriosi e misti verranno eseguiti prima dell'intervento e nelle successive 48 ore dopo la rimozione del cross-clamp aortico.

Oltre a misurare l'indice cardiaco, calcoleremo gli indici di lavoro cardiaco sinistro e destro. Verranno calcolati l'indice di apporto di ossigeno e il rapporto di estrazione. Saranno misurati anche i livelli di lattato. Gli investigatori valuteranno anche la necessità di supporto inotropo negli stessi punti temporali utilizzando il cosiddetto indice inotropo.

Tutti i pazienti avranno un elettrocardiogramma postoperatorio il giorno 2 e 4 come da routine di cura postoperatoria e inoltre il 1 ° giorno dopo l'operazione. Allo stesso modo verranno eseguiti, monitorati e utilizzati altri test postoperatori di routine che vengono eseguiti come parte della cura postoperatoria di routine per cercare le differenze nel decorso postoperatorio. Ciò include l'ecocardiografia e la creatinina (eGFR).