Ferngesteuerte ischämische Vorkonditionierung des menschlichen Myokards

Die Ermittler untersuchen:

1. Resistenz von isolierten Trabekeln des rechten atrialen Pektinatmuskels gegenüber simulierter Hypoxie/Reperfusion in einem funktionellen Organbadmodell
2. Resistenz von isolierten Trabekeln des rechten atrialen Pektinatmuskels gegen Induktion von Apoptose durch simulierte Hypoxie/Reperfusion
3. Resistenz von Mitochondrien in isolierten Trabekeln des rechten atrialen Pektinatmuskels gegenüber Veränderungen, die durch simulierte Hypoxie/Reperfusion induziert werden

Gleichzeitig bewerten wir:

1. Ausmaß der myokardialen Nekrose in vivo, induziert durch Ischämie und Reperfusion während der Koronararterien-Bypass-Operation (CABG), wie anhand des postoperativen Myokardnekrose-Marker-Freisetzungsprofils bewertet
2. Myokardfunktion in vivo nach Ischämie und Reperfusion während CABG, wie durch hämodynamische Messungen (Thermodilutionsverfahren), Sauerstoffversorgung/-verbrauch und inotrope Unterstützungsanforderungen bewertet
3. Induktion von Apoptose und Status von Mitochondrien nach der Periode der Ischämie und Reperfusion während CABG, wie in linksventrikulären Myokardbiopsien beurteilt. Die Forscher werden versuchen, die In-vitro- und In-vivo-Befunde derselben Patienten zu korrelieren.

Methodik Die Studie wird sowohl in vivo als auch ex-vivo durchgeführt. Patienten, die wegen stabiler koronarer Herzkrankheit an CABG überwiesen werden, werden per Zufallszahlengenerator rekrutiert und randomisiert (1:1) einer von zwei Gruppen zugeordnet: Fernpräkonditionierung oder „Placebo“-Intervention. Es werden nur Patienten eingeschlossen, bei denen mindestens 3 Koronararterien-Bypass-Transplantationen mit Verwendung eines kardiopulmonalen Bypasses (CPB) geplant sind. Am Tag der Operation, nach Einleitung der Anästhesie und vor dem Hautschnitt wird eine Fernpräkonditionierung durchgeführt. Der "Placebo"-Gruppe wird die Druckmanschette am rechten Arm angelegt, aber es werden keine Inflationen durchgeführt. Um eine Verblindung zu erreichen, erfolgt das Aufblasen unter chirurgischen Abdecktüchern und wird jedes Mal von derselben Person durchgeführt, die an der Generierung zufälliger Sequenzen und der ferngesteuerten Vorkonditionierungsanwendung beteiligt ist, jedoch nicht an der Pflege des Patienten oder anderen damit verbundenen Forschungsarbeiten Aufgaben.

Bei allen zugelassenen Patienten werden eine präoperative Echokardiographie, Elektrokardiographie und Blutuntersuchungen, einschließlich Blutbild, Kreatinin, BUN und Leberfunktionstest, durchgeführt, die als Teil ihrer routinemäßigen präoperativen Versorgung durchgeführt werden. Zusätzlich werden die Troponin T- und CK-MB-Spiegel bestimmt. Darüber hinaus müssen die Patienten am 1. Tag nach der Operation eine Elektrokardiographie durchgeführt haben.

Die Anästhesie wird standardisiert und besteht aus Midazolam 15 mg oral 1 Stunde vor der Operation, Etomidat 0,2 mg/kg, Fentanyl 5 g/kg und Pancuronium 0,1 mg/kg iv zur Narkoseeinleitung, Propofol 0,5-1,0 mg/kg/h und Fentanyl 4 g/kg/h Infusion zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Es werden keine Anästhesiegase verwendet. Mit dem Swan-Ganz-Katheter wird eine vollständige hämodynamische Überwachung durchgeführt (keine Routine bei CABG-Patienten). Präoperativ werden erste hämodynamische Messungen und Sauerstoffversorgungs-/Verbrauchsberechnungen durchgeführt.

Funktionelle In-vitro-Bewertung. Bei der Kanülierung für CPB wird bei allen Patienten das rechte Herzohr entnommen, das routinemäßig entfernt und für die venöse Kanülenplatzierung entsorgt wird. Das Gewebe wird in eiskalter Krebs-Henseleit-Lösung in das Isolierorganlabor unserer Abteilung überführt. Ein pektiniertes Muskeltrabekel wird für die Grundlinienbeurteilung von Apoptose oder Mitochondrien geerntet (siehe unten). Ein weiteres einzelnes Trabekel mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm wird in der Organkammer montiert – Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Deutschland (HSE)) mit Krebs-Henseleit-Lösung. Es wird über eine Glasfritte mit Carbogen (95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid) mit Sauerstoff angereichert und bei 37°C gehalten. Die Trabekel werden mit quadratischen Stimuli von 1 Hz 50 ms unter Verwendung von Platinfeldelektroden und dem Potential von 150 % der Schwelle für die gegebene Präparation getrieben. Es wird der Stimulator Typ 215 (HSE) verwendet. Die Kontraktionskraft wird mit dem isometrischen Kraftaufnehmer F30 Typ 372 (HSE) gemessen. Das Signal wird mit dem TAM A PlagSYS Transducer-Amplifier-Modul Type705 (HSE) verstärkt und mit dem PowerLab/4SP-System und der Chart-Software (AD Instruments) aufgezeichnet.

Die Trabekel werden gemäß der Frank-Starling-Beziehung allmählich auf 90 % der optimalen Spannung gedehnt und für 30 Minuten zur Stabilisierung und Auswaschung belassen.

Eine 60-minütige Ischämie wird simuliert, indem Sauerstoff in Carbogen durch Argon (95 % Argon, 5 % Kohlendioxid) ersetzt wird und Krebs-Henseleit-Lösung durch eine ersetzt wird, die weder Glucose noch Pyruvat enthält. Bei der Reoxygenierung wird das Carbogen erneut hinzugefügt und die Gewebebadlösung wird durch die ursprünglich verwendete ersetzt. Das Gewebe wird mehrmals gewaschen und für 120 Minuten Reoxygenierungszeitraum belassen, wobei alle 15 Minuten ausgewaschen wird. Dieses funktionelle Modell der Hypoxie-Reoxygenierung wurde in unserem Labor bereits früher verwendet [12-14]. Der Ersatz von Sauerstoff durch Argon führt zu einem Abfall des Sauerstoffpartialdrucks im Gewebebad von 475 ± 52 mmHg auf 51 ± 1,8 mmHg (p < 0,001) [37-39]. Es wird von einem signifikanten und schnellen Abfall der isometrischen Kontraktionskraft begleitet. Während der Reoxygenierung kehrt die Kontraktionskraft zunächst zurück und als nächstes beobachten wir einen langsamen Rückgang der Muskelinotropie, den wir als Entwicklung einer Reoxygenierungsverletzung interpretieren. Am Ende werden wir 10-4 M Norepinephrin ((-)-Arterenol Bitartrate) verwenden, um auf Betäubung zu testen.

Die Kontraktionskraft wird kontinuierlich aufgezeichnet. Die Kontraktionsfähigkeit wird in Prozent der anfänglichen Kontraktionskraft für eine gegebene Zubereitung ausgedrückt. Die Forscher vergleichen die maximal wiederhergestellte Kontraktionskraft, die Kontraktionskraft nach 30 Minuten und 120 Minuten Reoxygenierung und die Kontraktionskraft, die durch Zugabe von 10 –4 M Norepinephrin am Ende der Reoxygenierung erzeugt wird.

Die Ermittler werden auch nach Anzeichen einer ischämischen Kontrakturentwicklung suchen, die als eine Erhöhung der Ruhespannung der Trabekel definiert ist. Dieser Anstieg, falls vorhanden, beginnt kurz nach dem Einsetzen der Hypoxie und setzt sich während der gesamten Hypoxieperiode stetig fort. Die Untersucher vergleichen den Anstieg der Ruhespannung (in mN/mg Gewebemasse) am Ende der Hypoxie, also zum Zeitpunkt der maximalen Kontraktur.

Alle Messungen und insbesondere die Wiederherstellung der Funktion werden zwischen Trabekeln von entfernt vorkonditionierten und "Placebo"-Patienten verglichen.

Zwei atriale Trabekel aus demselben Anhängsel, eines zu Studienbeginn entnommen und das andere einem Funktionsexperiment (60 min Hypoxie + 120 min Reoxygenierung) unterzogen, werden jedes Mal untersucht auf:

• Apoptose-Induktion – Caspase 3 und gespaltene Caspase 3, PARP und gespaltene PARP-Expression, gemessen mit Western-Blot, oder
• Apoptoseinduktion – bewertet mit TUNEL und immunhistochemischer Färbung für Caspase 3, gespaltene Caspase 3, PARP und gespaltenes PARP, oder
• Zustand der Mitochondrien (Elektronenmikroskopie) Da wir planen, 120 Patienten zu randomisieren (siehe unten), wird das Material für Apoptose- und Mitochondrienstudien zufällig von 60 Patienten (30:30) für Western Blot, 40 Patienten (20:20) für Immunhistochemie entnommen und TUNEL und 20 Patienten (10:10) für die Elektronenmikroskopie.

Western Blot (2 Trabekel, Grundlinie und nach Hypoxie/Reoxygenierung, von 30 fern vorkonditionierten und 30 "Placebo"-Patienten).

Für den Western-Blot-Immunoassay werden die Trabekel in flüssigem Stickstoff platziert.

Die Expression von Caspase 3, gespaltener Caspase 3, PARP und gespaltenen PARP-Proteinen in Gewebeschnitten wird immunhistochemisch nachgewiesen. Trabekel werden über Nacht in 10% neutral gepuffertem Formalin (Phosphatpuffer) fixiert, anschließend durch abgestufte Alkohollösungen geleitet, dreimal in Xylol verarbeitet und schließlich in Paraffinblöcke eingebettet. Die Dokumentation der immunhistochemischen Reaktionen wird mit der Kamera SSC-DC58AP (Sony) gekoppelt mit dem optischen Mikroskop Nikon Eclipse E400 durchgeführt.

TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick and labeling) (2 Trabekel, Grundlinie und nach Hypoxie/Reoxygenierung, von 20 fern vorkonditionierten und 20 "Placebo"-Patienten).

Die Gewebeschnitte werden jeweils 5 Minuten lang zweimal mit Xylol entparaffiniert und jeweils 3 Minuten lang zweimal mit 100 %igem Ethanol und 1 Minute lang mit 95 %igem Ethanol hydratisiert. Die Dokumentation der immunhistochemischen Reaktionen wird mit der Kamera SSC-DC58AP (Sony) gekoppelt mit dem optischen Mikroskop Nikon Eclipse E400 durchgeführt.

Elektronenmikroskopie (2 Trabekel, Grundlinie und nach Hypoxie/Reoxygenierung, von 10 aus der Ferne vorkonditionierten und 10 "Placebo"-Patienten).

Trabeculae werden in Cacodyl-Puffer mit 2 % Glutaraldehyd gegeben. Die Mitochondrien werden mit einem Transmissionselektronenmikroskop JEOL-JEM 100CX (JEOL Inc, Peabody, Mass) mit 16000-facher Vergrößerung mikroskopisch aufgenommen. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen werden als nächstes gespeichert und die Größe und Struktur der Mitochondrien wird mit der Image ProPlus-Software (Media Scanalytics) analysiert.

Die In-vivo-Studie Die Operation wird unter Verwendung von CPB bei Normothermie von einem erfahrenen Herzchirurgen durchgeführt. Intermittierende Warmblut (37°C) antegrade Kardioplegie (Miniplegie) wird zum myokardialen Schutz verwendet. Da nur Patienten rekrutiert werden, die mindestens 3 koronare Bypass-Transplantate benötigen, erwarten wir, dass die Aorta-Crossclamp-Zeit mindestens 30 Minuten dauert. Nach Entfernung der Kreuzklemme werden die proximalen Anastomosen mit einer seitlichen Beißklemme durchgeführt. Der Patient wird von CPB entwöhnt, die Blutstillung wird gesichert und der Brustkorb wird über Thoraxdrainagen verschlossen. Unmittelbar vor dem Schließen des Brustkorbs wird eine 16G-Nadelechtschnittbiopsie des linksventrikulären Myokards aus dem Apexbereich entnommen. Die Prüfärzte rechnen mit einer Reperfusionszeit von der Kreuzklemmenentfernung bis zur Gewinnung der Biopsie von mindestens 40 min. Die genaue Ischämiezeit (Clamp) und die Reperfusionszeit (bis zur Entnahme der Biopsie) werden gemessen.

Die Myokardbiopsien werden auf die gleiche Weise wie Vorhofbälkchen entnommen und beurteilt. Die Ermittler führen zufällig Western Blotting an 60 (30:30) Biopsien durch, die auf flüssigem Stickstoff geerntet wurden, Immunhistochemie einschließlich TUNEL an 40 (20:20) Biopsien, die an 10 % neutral gepuffertem Formalin geerntet wurden, und Elektronenmikroskopie an 20 (10:10), die am geerntet wurden Cacodyl-Puffer mit 2 % Glutaraldehyd. Die Verfahren zur Bewertung von Caspase3, gespaltener Caspase 3, PARP, gespaltenem PARP, TUNEL und Mitochondrien wurden oben beschrieben.

Nach der Operation wird der Patient auf die Intensivstation verlegt und wie gewohnt behandelt.

Der primäre Endpunkt der klinischen Beobachtung wird die postoperative Freisetzung von kardialem Troponin T sein.

Die Forscher messen die Serumkonzentration von kardialem Troponin T (Elektrochemilumineszenz "ECLIA", Roche) präoperativ und die nächsten 72 Stunden nach der Entfernung der Kreuzklemme. Zu den gleichen Zeitpunkten wird der Gehalt an Kreatinkinase-Isoenzym MB bestimmt (enzymatischer Assay, Roche). Die Fläche unter der Kurve des Markerpegels über die Zeit wird zwischen den Gruppen verglichen.

Zur Beurteilung der Myokardfunktion wird allen Patienten präoperativ ein Pulmonalarterienkatheter (Swan-Ganz-Katheter) gelegt. Eine vollständige hämodynamische Beurteilung (Thermodilutionsmethode) sowie der Sauerstoffstoffwechselstatus basierend auf einer arteriellen und gemischtvenösen Gasanalyse werden präoperativ und die nächsten 48 Stunden nach Entfernung der Aortenkreuzklemme durchgeführt.

Neben der Messung des Herzindexes berechnen wir Links- und Rechtsherzarbeitsindizes. Der Sauerstoffabgabeindex und das Extraktionsverhältnis werden berechnet. Auch die Laktatwerte werden gemessen. Die Ermittler werden auch die Notwendigkeit einer inotropen Unterstützung zu den gleichen Zeitpunkten unter Verwendung des sogenannten inotropen Index beurteilen.

Alle Patienten erhalten am 2. und 4. Tag ein postoperatives Elektrokardiogramm gemäß der postoperativen Pflegeroutine und zusätzlich am 1. Tag nach der Operation. In ähnlicher Weise werden andere routinemäßige postoperative Tests, die als Teil der routinemäßigen postoperativen Versorgung durchgeführt werden, durchgeführt, überwacht und verwendet, um nach Unterschieden im postoperativen Verlauf zu suchen. Dazu gehören Echokardiographie sowie Kreatinin (eGFR).