Zdalne warunkowanie niedokrwienne ludzkiego mięśnia sercowego

Śledczy będą badać:

1. Odporność izolowanych beleczek mięśnia sercowatego prawego przedsionka na symulowaną hipoksję/reperfuzję w funkcjonalnym modelu kąpieli narządów
2. Odporność izolowanych beleczek mięśnia sercowatego prawego przedsionka na indukcję apoptozy przez symulowaną hipoksję/reperfuzję
3. Odporność mitochondriów izolowanych beleczek mięśnia sercowatego prawego przedsionka na zmiany wywołane symulowaną niedotlenieniem/reperfuzją

Jednocześnie ocenimy:

1. Stopień martwicy mięśnia sercowego in vivo wywołany okresem niedokrwienia i reperfuzji podczas wszczepiania pomostów aortalno-wieńcowych (CABG) oceniany na podstawie profilu uwalniania markerów martwicy mięśnia sercowego po operacji
2. Czynność mięśnia sercowego in vivo po okresie niedokrwienia i reperfuzji podczas CABG oceniana na podstawie pomiarów hemodynamicznych (metoda termodylucji), podaży/zużycia tlenu i zapotrzebowania na wsparcie inotropowe
3. Indukcja apoptozy i stan mitochondriów po okresie niedokrwienia oraz reperfuzja podczas CABG w ocenie biopsji mięśnia sercowego lewej komory. Badacze spróbują skorelować wyniki badań in vitro i in vivo u tych samych pacjentów.

Metodologia Badanie zostanie przeprowadzone zarówno in vivo, jak i ex vivo. Pacjenci skierowani na CABG z powodu stabilnej choroby wieńcowej będą rekrutowani i randomizowani (1:1) przez generator liczb losowych do jednej z dwóch grup: zdalne przygotowanie wstępne lub interwencja „placebo”. Uwzględnieni zostaną tylko pacjenci, u których planowane są co najmniej 3 pomosty aortalno-wieńcowe z zastosowaniem krążenia pozaustrojowego (CPB). W dniu zabiegu, po indukcji znieczulenia, a przed nacięciem skóry, zostanie wywołane zdalne kondycjonowanie. Grupa „placebo” będzie miała założony mankiet ciśnieniowy na prawe ramię, ale nie będą wykonywane żadne napełnienia. Aby uzyskać zaślepienie, nadmuchiwanie będzie odbywać się pod obłożeniami chirurgicznymi i będzie wykonywane za każdym razem przez tę samą osobę, która będzie zaangażowana w generowanie sekwencji losowych i zdalne stosowanie kondycjonowania wstępnego, ale nie w opiekę nad pacjentem lub inne badania związane zadania.

W ramach rutynowej opieki przedoperacyjnej wszyscy pacjenci, którzy wyrazili zgodę, zostaną poddani przedoperacyjnej echokardiografii, elektrokardiografii i badaniom krwi, w tym morfologii krwi, kreatyniny, BUN i badaniu czynności wątroby. Dodatkowo zostaną ocenione poziomy troponiny T i CK-MB. Ponadto pacjenci będą mieli wykonane badanie elektrokardiograficzne w 1. dobie po operacji.

Znieczulenie będzie standaryzowane i składa się z midazolamu 15mg doustnie 1h przed operacją, etomidatu 0,2mg/kg, fentanylu 5g/kg i pankuronium 0,1mg/kg iv do indukcji znieczulenia, propofolu 0,5-1,0 mg/kg/h i fentanyl 4 g/kg/h we wlewie do podtrzymania znieczulenia. Nie będą używane żadne gazy znieczulające. Zastosowane zostanie pełne monitorowanie hemodynamiczne z cewnikiem Swana-Ganza (nie jest to rutynowe u pacjentów po CABG). Pierwsze pomiary hemodynamiczne i obliczenia podaży/zużycia tlenu zostaną wykonane przed operacją.

Funkcjonalna ocena in vitro. Podczas kaniulacji do CPB, u wszystkich pacjentów zostanie pobrany uszka prawego przedsionka, który jest rutynowo usuwany i odrzucany w celu umieszczenia kaniuli żylnej. Tkanka zostanie przeniesiona w lodowatym roztworze Krebsa-Henseleita do laboratorium izolowanych narządów w naszym oddziale. Jedna beleczka mięśnia pektynowego zostanie pobrana do podstawowej oceny apoptozy lub mitochondriów (patrz poniżej). Kolejna pojedyncza beleczka o średnicy mniejszej niż 1 mm zostanie zamontowana w komorze narządowej - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Niemcy (HSE)) zawierająca roztwór Krebsa-Henseleita. Będzie on natleniany za pomocą fryty szklanej karbogenem (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla) i utrzymywany w temperaturze 37°C. Beleczka będzie napędzana bodźcami kwadratowymi 1Hz 50ms z wykorzystaniem platynowych elektrod polowych i potencjałem 150% wartości progowej dla danego preparatu. Stosowany będzie stymulator typu 215 (HSE). Siła skurczu będzie mierzona izometrycznym przetwornikiem siły F30 typu 372 (HSE). Sygnał będzie wzmacniany modułem wzmacniacza przetwornikowego TAM A PlagSYS Type705 (HSE) i rejestrowany za pomocą systemu PowerLab/4SP i oprogramowania Chart (AD Instruments).

Beleczka będzie stopniowo rozciągana do 90% optymalnego napięcia zgodnie z zależnością Franka-Starlinga i pozostawiona na 30 minut stabilizacji i wypłukania.

60-minutowe niedokrwienie będzie symulowane poprzez zastąpienie tlenu w karbogenie argonem (95% argonu, 5% dwutlenku węgla) i zastąpienie roztworu Krebsa-Henseleita roztworem nie zawierającym glukozy ani pirogronianu. Podczas ponownego natlenienia karbogen zostanie ponownie dodany, a roztwór do kąpieli tkankowej zostanie zastąpiony tym, który był używany początkowo. Tkanka zostanie kilkakrotnie przemyta i pozostawiona na 120 min okresu reoksygenacji z wypłukiwaniem co 15 min. Ten funkcjonalny model reoksygenacji hipoksji był już wcześniej stosowany w naszym laboratorium [12-14]. Zastąpienie tlenu argonem powoduje spadek ciśnienia parcjalnego tlenu w kąpieli tkankowej z 475±52mmHg do 51±1,8mmHg (p<0,001) [37-39]. Towarzyszy temu znaczny i szybki spadek siły skurczu izometrycznego. Podczas reoksygenacji siła skurczu początkowo powraca, a następnie obserwujemy powolny spadek inotropizmu mięśniowego, co interpretujemy jako rozwój uszkodzenia reoksygenacyjnego. Na koniec użyjemy 10-4 M dwuwinianu noradrenaliny ((-)-arterenolu) do przetestowania ogłuszenia.

Siła skurczu będzie rejestrowana w sposób ciągły. Kurczliwość będzie wyrażona w procentach początkowej siły skurczu dla danego preparatu. Badacze porównają maksymalną odzyskaną siłę skurczu, siłę skurczu po 30 minutach i 120 minutach ponownego natlenienia oraz siłę skurczu wywołaną dodaniem 10-4 M norepinefryny pod koniec ponownego natlenienia.

Badacze będą również poszukiwać oznak rozwoju przykurczu niedokrwiennego określanego jako wzrost napięcia spoczynkowego beleczek. Ten wzrost, jeśli występuje, rozpoczyna się wkrótce po wystąpieniu niedotlenienia i trwa stabilnie przez cały okres niedotlenienia. Badacze porównają wzrost napięcia spoczynkowego (w mN/mg masy tkanki) pod koniec hipoksji, czyli w momencie maksymalnego przykurczu.

Wszystkie pomiary, aw szczególności powrót funkcji, zostaną porównane między beleczkami od zdalnie wstępnie kondycjonowanych pacjentów i pacjentów otrzymujących placebo.

Dwie beleczki przedsionkowe z tego samego uszka, jeden pobrany na początku badania, a drugi poddany eksperymentowi czynnościowemu (60 min hipoksji + 120 min reoksygenacji) będą badane za każdym razem pod kątem:

• indukcja apoptozy - ekspresja kaspazy 3 i rozszczepionej kaspazy 3, PARP i rozszczepionej PARP mierzona metodą Western-Blot lub
• indukcja apoptozy - oceniana za pomocą TUNEL i barwienia immunohistochemicznego dla kaspazy 3, rozszczepionej kaspazy 3, PARP i rozszczepionego PARP, lub
• stan mitochondriów (mikroskopia elektronowa) Ponieważ planujemy randomizować 120 pacjentów (patrz poniżej), materiał do badań apoptozy i mitochondriów zostanie losowo pobrany od 60 pacjentów (30:30) do Western Blot, 40 pacjentów (20:20) do immunohistochemii i TUNEL oraz 20 pacjentów (10:10) do mikroskopii elektronowej.

Western Blot (2 beleczki, linia podstawowa i po niedotlenieniu/reoksygenacji, od 30 zdalnie wstępnie kondycjonowanych i 30 pacjentów „placebo”).

Do testu immunologicznego Western Blot beleczki zostaną umieszczone w ciekłym azocie immunohistochemicznym (2 beleczki, linia podstawowa i po niedotlenieniu/reoksygenacji, od 20 zdalnie wstępnie kondycjonowanych i 20 pacjentów „placebo”).

Ekspresja kaspazy 3, rozszczepionej kaspazy 3, PARP i rozszczepionych białek PARP w skrawkach tkanek zostanie wykryta immunohistochemicznie. Beleczki zostaną utrwalone przez noc w 10% obojętnie buforowanej formalinie (bufor fosforanowy), następnie przepuszczone przez różne roztwory alkoholowe, poddane trzykrotnej obróbce w ksylenie i ostatecznie zatopione w bloczkach parafinowych. Dokumentacja reakcji immunohistochemicznych będzie prowadzona za pomocą kamery SSC-DC58AP (Sony) sprzężonej z mikroskopem optycznym Nikon Eclipse E400.

TUNEL (nacięcie i znakowanie terminalnej transferazy deoksynukleotydylowej dUTP) (2 beleczki, linia podstawowa i po niedotlenieniu/reoksygenacji, od 20 zdalnie wstępnie kondycjonowanych i 20 pacjentów „placebo”).

Skrawki tkanki będą odparafinowane w 2 zmianach ksylenu przez 5 minut każda i uwodnione 2 zmianami 100% etanolu przez 3 minuty każda i 95% etanolu przez 1 minutę. Dokumentacja reakcji immunohistochemicznych będzie prowadzona za pomocą kamery SSC-DC58AP (Sony) sprzężonej z mikroskopem optycznym Nikon Eclipse E400.

Mikroskopia elektronowa (2 beleczki, linia podstawowa i po niedotlenieniu/reoksygenacji, od 10 zdalnie wstępnie kondycjonowanych i 10 pacjentów „placebo”).

Beleczki zostaną umieszczone w buforze cacodyl z 2% aldehydem glutarowym. Mitochondria będą mikrografowane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEOL-JEM 100CX (JEOL Inc, Peabody, Mass) przy powiększeniu x16000. Mikrografie elektronowe zostaną następnie zapisane, a rozmiar i struktura mitochondriów zostaną przeanalizowane za pomocą oprogramowania Image ProPlus (Media Scanalytics).

Próba in vivo Operacja zostanie przeprowadzona z użyciem CPB w normotermii przez doświadczonego kardiochirurga. W celu ochrony mięśnia sercowego stosowana będzie okresowa kardioplegia wstępna (miniplegia) z ciepłą krwią (37°C). Ponieważ rekrutowani będą tylko pacjenci wymagający co najmniej 3 pomostów wieńcowych, spodziewamy się, że czas zacisku krzyżowego aorty będzie trwał co najmniej 30 minut. Po zdjęciu zacisku krzyżowego, zespolenia proksymalne zostaną wykonane za pomocą zacisku bocznego zgryzowego. Pacjent zostanie odłączony od CPB, zapewniona zostanie hemostaza, a klatka piersiowa zostanie zamknięta rurkami klatki piersiowej. Tuż przed zamknięciem klatki piersiowej zostanie pobrana biopsja cienkoigłowa 16G mięśnia sercowego lewej komory z okolic wierzchołka. Badacze spodziewają się, że czas reperfuzji od zdjęcia zacisku krzyżowego do pobrania biopsji wyniesie co najmniej 40 minut. Zmierzony zostanie dokładny czas niedokrwienia (zacisk krzyżowy) i czas reperfuzji (do uzyskania biopsji).

Biopsje mięśnia sercowego będą pobierane i oceniane w taki sam sposób jak beleczki przedsionkowe. Badacze losowo wykonają Western blotting w 60 (30:30) biopsjach pobranych na ciekłym azocie, immunohistochemię, w tym TUNEL w 40 (20:20) zebranych na 10% obojętnej zbuforowanej formalinie i mikroskopię elektronową w 20 (10:10) zebranych na bufor cacodyl z 2% aldehydem glutarowym. Metody oceny kaspazy 3, rozszczepionej kaspazy 3, PARP, rozszczepionej PARP, TUNEL i mitochondriów opisano powyżej.

Po operacji pacjent zostanie przeniesiony na OIT i będzie leczony rutynowo.

Pierwszorzędowym punktem końcowym obserwacji klinicznej będzie pooperacyjne uwolnienie troponiny sercowej T.

Badacze zmierzą stężenie troponiny sercowej T w surowicy (elektrochemiluminescencja „ECLIA”, Roche) przed operacją i po 72 godzinach od zdjęcia zacisku krzyżowego. W tym samym czasie zostanie oznaczony poziom izoenzymu MB kinazy kreatynowej (test enzymatyczny firmy Roche). Obszar pod krzywą poziomu znacznika w czasie zostanie porównany między grupami.

W celu oceny funkcji mięśnia sercowego wszyscy pacjenci będą mieli założony cewnik do tętnicy płucnej (cewnik Swana Ganza) przed operacją. Pełna ocena hemodynamiczna (metoda termodylucji) oraz stanu gospodarki tlenowej na podstawie analizy gazów tętniczych i mieszanych gazów żylnych zostanie przeprowadzona przed operacją i po 48 godzinach od usunięcia zacisku aortalnego.

Oprócz pomiaru wskaźnika sercowego obliczymy również wskaźniki pracy serca prawego i lewego. Zostanie obliczony wskaźnik dostarczania tlenu i stopień ekstrakcji. Zmierzony zostanie również poziom mleczanu. Badacze ocenią również potrzebę wsparcia inotropowego w tych samych punktach czasowych za pomocą tzw. wskaźnika inotropowego.

Wszyscy pacjenci będą mieli pooperacyjny elektrokardiogram w 2. i 4. dniu zgodnie z rutynową opieką pooperacyjną oraz dodatkowo w 1. dniu po operacji. Podobnie inne rutynowe badania pooperacyjne wykonywane w ramach rutynowej opieki pooperacyjnej będą wykonywane, monitorowane i wykorzystywane do poszukiwania różnic w przebiegu pooperacyjnym. Obejmuje to echokardiografię, a także kreatyninę (eGFR).