Дистанционное ишемическое прекондиционирование миокарда человека

Следователи изучат:

1. Устойчивость изолированных трабекул гребенчатой ​​мышцы правого предсердия к симулированной гипоксии/реперфузии в модели ванн функционального органа
2. Устойчивость изолированных трабекул гребенчатой ​​мышцы правого предсердия к индукции апоптоза путем имитации гипоксии/реперфузии
3. Устойчивость митохондрий изолированных трабекул гребенчатой ​​мышцы правого предсердия к изменениям, индуцированным моделируемой гипоксией/реперфузией

Параллельно мы оценим:

1. Объем некроза миокарда in vivo, вызванный периодом ишемии и реперфузии во время аортокоронарного шунтирования (АКШ), по оценке послеоперационного профиля высвобождения маркеров некроза миокарда
2. Функция миокарда in vivo после периода ишемии и реперфузии при АКШ по данным гемодинамических измерений (метод термодилюции), доставки/потребления кислорода и потребности в инотропной поддержке
3. Индукция апоптоза и состояние митохондрий после периода ишемии и реперфузии во время КШ по оценке биопсии миокарда левого желудочка. Исследователи попытаются сопоставить данные, полученные in vitro и in vivo у одних и тех же пациентов.

Методология Исследование будет проводиться как in vivo, так и ex-vivo. Пациенты, направленные на АКШ по поводу стабильной ишемической болезни сердца, будут набраны и рандомизированы (1:1) с помощью генератора случайных чисел в одну из двух групп: дистанционное предварительное кондиционирование или вмешательство «плацебо». Будут включены только пациенты, у которых запланировано не менее 3 коронарных шунтов с использованием искусственного кровообращения (ИК). В день операции, после индукции анестезии и перед разрезом кожи будет вызываться дистанционное прекондиционирование. Группе «плацебо» на правую руку будет наложена манжета для давления, но надувание не будет выполняться. Чтобы получить ослепление, надувание будет происходить под хирургическими простынями и будет выполняться каждый раз одним и тем же человеком, который будет участвовать в генерации случайных последовательностей и применении дистанционного прекондиционирования, но не при уходе за пациентом или других исследованиях, связанных с задания.

Все согласившиеся пациенты будут проходить предоперационную эхокардиографию, электрокардиографию и анализы крови, включая общий анализ крови, креатинин, мочевину мочевины и тест функции печени, которые будут выполняться в рамках их обычного предоперационного ухода. Дополнительно будут оцениваться уровни тропонина Т и CK-MB. Кроме того, пациентам будет выполнена электрокардиография в 1-й день после операции.

Анестезия будет стандартизирована и будет состоять из мидазолама 15 мг перорально за 1 час до операции, этомидата 0,2 мг/кг, фентанила 5 г/кг и панкурония 0,1 мг/кг внутривенно для индукции анестезии, пропофола 0,5-1,0. мг/кг/ч и инфузия фентанила 4 г/кг/ч для поддержания анестезии. Не будут использоваться анестезирующие газы. Полный гемодинамический мониторинг будет использоваться с катетером Свана-Ганца (не является рутинным у пациентов с АКШ). Первые гемодинамические измерения и расчеты подачи/потребления кислорода будут выполнены до операции.

Функциональная оценка in vitro. При канюляции для искусственного кровообращения у всех пациентов извлекают ушко правого предсердия, которое обычно удаляют и выбрасывают для установки венозной канюли. Ткань будет перенесена в ледяной раствор Кребса-Хензелейта в лабораторию изолированных органов в нашем отделении. Одна трабекула гребенчатой ​​мышцы будет собрана для базовой оценки апоптоза или митохондрий (см. ниже). Еще одна одиночная трабекула диаметром менее 1 мм будет установлена ​​в органной камере - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Germany (HSE)), содержащая раствор Krebs-Henseleit. Он будет насыщаться кислородом через стеклянную фритту с карбогеном (95% кислорода, 5% углекислого газа) и поддерживаться при 37°C. Трабекула будет управляться квадратными стимулами с частотой 1 Гц 50 мс с использованием платиновых полевых электродов и потенциалом 150% от порога для данного препарата. Будет использоваться стимулятор Тип 215 (HSE). Сила сокращения будет измеряться датчиком изометрической силы F30 типа 372 (HSE). Сигнал будет усилен модулем усилителя преобразователя TAM A PlagSYS Type705 (HSE) и записан с использованием системы PowerLab/4SP и программного обеспечения Chart (AD Instruments).

Трабекулу постепенно растягивают до 90% оптимального натяжения в соответствии с соотношением Франка-Старлинга и оставляют на 30 минут для стабилизации и вымывания.

60-минутную ишемию моделируют заменой кислорода в углероде аргоном (95% аргона, 5% углекислого газа) и заменой раствора Кребса-Хензелейта раствором, не содержащим глюкозы или пирувата. При реоксигенации карбоген будет добавлен снова, а раствор для ванны для тканей будет заменен тем, который использовался первоначально. Ткань промывают несколько раз и оставляют на 120 минут периода реоксигенации с промывкой каждые 15 минут. Эта функциональная модель реоксигенации гипоксии использовалась в нашей лаборатории ранее [12-14]. Замена кислорода аргоном приводит к падению парциального давления кислорода в тканевой ванне с 475±52 мм рт.ст. до 51±1,8 мм рт.ст. (p<0,001). [37-39]. Сопровождается значительным и быстрым снижением силы изометрического сокращения. Во время реоксигенации сила сокращения сначала возвращается, а затем мы наблюдаем медленное снижение мышечного инотропизма, которое мы интерпретируем как развитие реоксигенационного повреждения. В конце мы будем использовать 10-4 М норэпинефрина ((-)-артеренола битартрата) для проверки оглушения.

Сила сжатия будет записываться непрерывно. Сократимость выражается в процентах от начальной силы сокращения для данного препарата. Исследователи будут сравнивать максимальную восстановленную силу сокращения, силу сокращения через 30 и 120 минут реоксигенации и силу сокращения, вызванную добавлением 10-4 М норадреналина в конце реоксигенации.

Исследователи также будут искать признаки развития ишемической контрактуры, определяемой как увеличение напряжения покоя трабекулы. Это увеличение, если оно присутствует, начинается вскоре после начала гипоксии и продолжается устойчиво в течение всего периода гипоксии. Исследователи будут сравнивать увеличение напряжения покоя (в мН/мг массы ткани) в конце гипоксии, то есть во время максимальной контрактуры.

Все измерения, и, в частности, восстановление функции, будут сравниваться между трабекулами пациентов, прошедших дистанционную предварительную подготовку, и пациентов, получавших плацебо.

Две трабекулы предсердий из одного и того же ушка, одна из которых собрана на исходном уровне, а другая подвергнута функциональному эксперименту (60 минут гипоксии + 120 минут реоксигенации), будут каждый раз изучаться для:

• индукция апоптоза - каспаза 3 и расщепленная каспаза 3, экспрессия PARP и расщепленной PARP, измеренная с помощью вестерн-блоттинга, или
• индукция апоптоза - оценивается с помощью TUNEL и иммуногистохимического окрашивания на каспазу 3, расщепленную каспазу 3, PARP и расщепленную PARP, или
• состояние митохондрий (электронная микроскопия) Поскольку мы планируем рандомизировать 120 пациентов (см. ниже), материал для исследования апоптоза и митохондрий будет взят случайным образом у 60 пациентов (30:30) для вестерн-блоттинга, у 40 пациентов (20:20) для иммуногистохимии и TUNEL, и 20 пациентов (10:10) для электронной микроскопии.

Вестерн-блоттинг (2 трабекулы, исходный уровень и после гипоксии/реоксигенации, от 30 пациентов с дистанционным прекондиционированием и 30 пациентов, получавших плацебо).

Для иммуноанализа вестерн-блоттинга трабекулы будут помещены в жидкий азот. Иммуногистохимия (2 трабекулы, исходный уровень и после гипоксии/реоксигенации, от 20 удаленно прекондиционированных и 20 пациентов, получавших плацебо).

Экспрессию каспазы 3, расщепленной каспазы 3, PARP и расщепленных белков PARP в срезах ткани определяют иммуногистохимически. Трабекулы фиксируют в течение ночи в 10% нейтральном формалине (фосфатном буфере), затем пропускают через спиртовые растворы, трижды обрабатывают ксилолом и, наконец, заливают в парафиновые блоки. Документирование иммуногистохимических реакций будет осуществляться с помощью камеры SSC-DC58AP (Sony) в сочетании с оптическим микроскопом Nikon Eclipse E400.

TUNEL (терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP, ник и маркировка) (2 трабекулы, исходный уровень и после гипоксии/реоксигенации, от 20 отдаленно прекондиционированных и 20 пациентов, получавших плацебо).

Срезы ткани будут депарафинизированы в 2 сменах ксилола по 5 минут каждая и гидратированы 2 сменами 100% этанола по 3 минуты каждая и 95% этанолом в течение 1 минуты. Документирование иммуногистохимических реакций будет осуществляться с помощью камеры SSC-DC58AP (Sony) в сочетании с оптическим микроскопом Nikon Eclipse E400.

Электронная микроскопия (2 трабекулы, исходный уровень и после гипоксии/реоксигенации, от 10 дистанционно прекондиционированных и 10 пациентов, получавших плацебо).

Трабекулы помещают в какодиловый буфер с 2% глутаральдегидом. Митохондрии будут микрофотографированы с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEOL-JEM 100CX (JEOL Inc, Peabody, Mass) с увеличением x16000. Затем будут сохранены электронные микрофотографии, а размер и структура митохондрий будут проанализированы с использованием программного обеспечения Image ProPlus (Media Scanalytics).

Испытание in vivo Операция будет проводиться с использованием искусственного кровообращения в условиях нормотермии опытным кардиохирургом. Прерывистая теплокровная (37°C) антеградная кардиоплегия (миниплегия) будет использоваться для защиты миокарда. Поскольку будут набраны только пациенты, которым требуется как минимум 3 коронарных шунтирования, мы ожидаем, что время пережатия аорты продлится не менее 30 минут. После снятия поперечного зажима накладывают проксимальные анастомозы боковым прикусным зажимом. Пациент будет отлучен от искусственного кровообращения, гемостаз будет обеспечен, а грудная клетка будет закрыта дренажными трубками. Непосредственно перед закрытием грудной клетки иглой 16G будет получена биопсия миокарда левого желудочка из области верхушки. Исследователи ожидают, что время реперфузии от снятия пережимного зажима до получения биопсии будет длиться не менее 40 минут. Будет измерено точное время ишемии (пережатия) и время реперфузии (до получения биопсии).

Биоптаты миокарда будут собираться и оцениваться так же, как и трабекулы предсердий. Исследователи случайным образом проведут Вестерн-блоттинг в 60 (30:30) биоптатах, собранных на жидком азоте, иммуногистохимию, включая TUNEL, в 40 (20:20), собранных на 10% нейтральном забуференном формалине, и электронную микроскопию в 20 (10:10), собранных на какодиловый буфер с 2% глутаровым альдегидом. Методы оценки каспазы 3, расщепленной каспазы 3, PARP, расщепленной PARP, TUNEL и митохондрий описаны выше.

После операции пациент будет переведен в отделение интенсивной терапии и будет лечиться в соответствии с установленной практикой.

Первичной конечной точкой клинического наблюдения будет послеоперационный выброс сердечного тропонина Т.

Исследователи будут измерять концентрацию сердечного тропонина Т в сыворотке крови (электрохемилюминесценция "ECLIA", Roche) до операции и через 72 часа после снятия пережатия. В эти же моменты времени будет оцениваться уровень изофермента креатинкиназы MB (ферментативный анализ, Roche). Площадь под кривой уровня маркера с течением времени будет сравниваться между группами.

Для оценки функции миокарда всем пациентам перед операцией вводят катетер в легочную артерию (катетер Свана-Ганца). Полная гемодинамическая оценка (метод термодилюции), а также состояние метаболизма кислорода на основе анализа газов артериальной и смешанной венозной крови будут выполнены до операции и через 48 часов после снятия поперечного зажима аорты.

Помимо измерения сердечного индекса мы рассчитаем показатели работы левого и правого сердца. Будут рассчитаны индекс доставки кислорода и коэффициент извлечения. Уровень лактата также будет измерен. Исследователи также будут оценивать потребность в инотропной поддержке в те же моменты времени, используя так называемый инотропный индекс.

Всем пациентам послеоперационная электрокардиограмма будет сделана на 2-й и 4-й день в соответствии с рутинным послеоперационным уходом и дополнительно в 1-й день после операции. Точно так же другие обычные послеоперационные тесты, которые выполняются как часть обычного послеоперационного ухода, будут выполняться, контролироваться и использоваться для поиска различий в послеоперационном течении. Это включает в себя эхокардиографию, а также креатинин (рСКФ).