Préconditionnement ischémique à distance du myocarde humain

Les enquêteurs étudieront :

1. Résistance des trabécules musculaires pectinées auriculaires droites isolées à l'hypoxie/reperfusion simulée dans un modèle de bain d'organe fonctionnel
2. Résistance des travées musculaires pectinées auriculaires droites isolées à l'induction de l'apoptose par hypoxie/reperfusion simulée
3. Résistance des mitochondries dans des trabécules musculaires pectinées auriculaires droites isolées aux changements induits par une hypoxie/reperfusion simulée

Nous évaluerons simultanément :

1. Quantité de nécrose myocardique in vivo induite par la période d'ischémie et de reperfusion au cours d'un pontage aortocoronarien (CABG) telle qu'évaluée par le profil de libération des marqueurs de nécrose myocardique postopératoire
2. Fonction myocardique in vivo après la période d'ischémie et de reperfusion pendant le pontage coronarien, évaluée par des mesures hémodynamiques (méthode de thermodilution), l'apport/la consommation d'oxygène et les exigences de soutien inotrope
3. Induction de l'apoptose et état des mitochondries après la période d'ischémie et reperfusion pendant le pontage coronarien tel qu'évalué dans les biopsies myocardiques ventriculaires gauches Les chercheurs tenteront de corréler les résultats in vitro et in vivo des mêmes patients.

Méthodologie L'étude sera menée à la fois in vivo et ex-vivo. Les patients référés pour CABG pour maladie coronarienne stable seront recrutés et randomisés (1:1) par générateur de chiffres aléatoires dans l'un des deux groupes : préconditionnement à distance ou intervention "placebo". Seuls les patients chez qui au moins 3 pontages aorto-coronariens avec recours à la circulation extracorporelle (PCB) sont prévus seront inclus. Le jour de l'intervention, après l'induction de l'anesthésie et avant l'incision cutanée, un préconditionnement à distance sera déclenché. Le groupe "placebo" aura le brassard de pression placé sur le bras droit mais aucun gonflage ne sera effectué. Pour obtenir la mise en aveugle, les gonflages se produiront sous des draps chirurgicaux et seront effectués par la même personne à chaque fois, qui sera impliquée dans la génération de séquences aléatoires et l'application de préconditionnement à distance, mais pas dans les soins du patient ou d'autres recherches liées. Tâches.

Tous les patients consentants subiront une échocardiographie préopératoire, une électrocardiographie et des tests sanguins, y compris la numération globulaire, la créatinine, l'urée et le test de la fonction hépatique, effectués dans le cadre de leurs soins préopératoires de routine. De plus, les niveaux de troponine T et de CK-MB seront évalués. De plus, les patients auront effectué une électrocardiographie le 1er jour après l'opération.

L'anesthésie sera standardisée et consistera en midazolam 15 mg par voie orale 1 h avant la chirurgie, étomidate 0,2 mg/kg, fentanyl 5 g/kg et pancuronium 0,1 mg/kg iv pour l'induction de l'anesthésie, propofol 0,5-1,0 mg/kg/h et perfusion de fentanyl 4g/kg/h pour le maintien de l'anesthésie. Aucun gaz anesthésique ne sera utilisé. Une surveillance hémodynamique complète sera utilisée avec le cathéter de Swan-Ganz (pas de routine chez les patients PAC). Des premières mesures hémodynamiques et des calculs d'apport/consommation d'oxygène seront effectués en préopératoire.

Évaluation fonctionnelle in vitro. Lors de la canulation pour la CEC, l'appendice auriculaire droit, qui est systématiquement retiré et jeté pour le placement de la canule veineuse, sera prélevé chez tous les patients. Le tissu sera transféré dans une solution glacée de Krebs-Henseleit au laboratoire d'organes isolés de notre service. Une trabécule de muscle pectiné sera récoltée pour l'évaluation de base de l'apoptose ou des mitochondries (voir ci-dessous). Une autre trabécule unique de moins de 1 mm de diamètre sera montée dans la chambre de l'organe - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Allemagne (HSE)) contenant la solution de Krebs-Henseleit. Il sera oxygéné via une fritte de verre avec du carbogène (95% d'oxygène, 5% de dioxyde de carbone) et maintenu à 37°C. La trabécule sera entraînée avec des stimuli carrés de 1 Hz de 50 ms à l'aide d'électrodes de champ en platine et du potentiel de 150 % du seuil pour une préparation donnée. Le stimulateur Type 215 (HSE) sera utilisé. La force de contraction sera mesurée avec le capteur de force isométrique F30 Type 372 (HSE). Le signal sera amélioré avec le module amplificateur de transducteur TAM A PlagSYS Type705 (HSE) et enregistré à l'aide du système PowerLab/4SP et du logiciel Chart (AD Instruments).

La trabécule sera progressivement étirée jusqu'à 90 % de la tension optimale selon la relation de Frank-Starling et laissée pendant 30 min de stabilisation et de lavage.

Une ischémie de 60 minutes sera simulée en remplaçant l'oxygène dans le carbogène par de l'argon (95 % d'argon, 5 % de dioxyde de carbone) et en remplaçant la solution de Krebs-Henseleit par une solution ne contenant ni glucose ni pyruvate. Lors de la réoxygénation, le carbogène sera ajouté à nouveau et la solution de bain de tissu sera remplacée par celle utilisée initialement. Le tissu sera lavé plusieurs fois et laissé pendant 120 minutes de période de réoxygénation avec lavage toutes les 15 minutes. Ce modèle fonctionnel de réoxygénation de l'hypoxie a déjà été utilisé dans notre laboratoire [12-14]. Le remplacement de l'oxygène par de l'argon entraîne une chute de la pression partielle d'oxygène du bain de tissus de 475 ± 52 mmHg à 51 ± 1,8 mmHg (p < 0,001) [37-39]. Elle s'accompagne d'une diminution importante et rapide de la force de contraction isométrique. Au cours de la réoxygénation, la force de contraction revient initialement et ensuite nous observons un lent déclin de l'inotropisme musculaire que nous interprétons comme le développement d'une lésion de réoxygénation. À la fin, nous utiliserons 10-4 M de noradrénaline ((-)-Arterenol Bitartrate) pour tester l'étourdissement.

La force de contraction sera enregistrée en continu. La contractilité sera exprimée en pourcentage de la force de contraction initiale pour une préparation donnée. Les chercheurs compareront la force de contraction maximale récupérée, la force de contraction après 30min et 120min de réoxygénation et la force de contraction produite par l'ajout de noradrénaline 10-4M à la fin de la réoxygénation.

Les enquêteurs rechercheront également les signes de développement d'une contracture ischémique définie comme une augmentation de la tension de repos de la trabécule. Cette augmentation, si elle est présente, commence peu de temps après le début de l'hypoxie et se poursuit régulièrement tout au long de la période d'hypoxie. Les chercheurs compareront l'augmentation de la tension au repos (en mN/mg de masse tissulaire) à la fin de l'hypoxie, c'est-à-dire au moment de la contracture maximale.

Toutes les mesures, et en particulier la récupération de la fonction, seront comparées entre les trabécules de patients préconditionnés à distance et « placebo ».

Deux trabécules auriculaires d'un même appendice, une prélevée à l'inclusion et une autre soumise à une expérience fonctionnelle (60 min d'hypoxie + 120 min de réoxygénation) seront étudiées à chaque fois pour :

• induction de l'apoptose - expression de la caspase 3 et de la caspase 3 clivée, de la PARP et de la PARP clivée mesurée par Western-Blot, ou
• induction de l'apoptose - évaluée avec TUNEL et coloration immunohistochimique pour Caspase 3, Caspase 3 clivée, PARP et PARP clivée, ou
• état des mitochondries (microscopie électronique) Comme nous prévoyons de randomiser 120 patients (voir ci-dessous) le matériel pour les études d'apoptose et de mitochondries sera prélevé au hasard sur 60 patients (30:30) pour le Western Blot, 40 patients (20:20) pour l'immunohistochimie et TUNEL, et 20 patients (10:10) pour la microscopie électronique.

Western Blot (2 trabécules, à l'inclusion et après hypoxie/réoxygénation, chez 30 patients préconditionnés à distance et 30 patients "placebo").

Pour le test immunologique Western Blot, les trabécules seront placées dans l'immunohistochimie de l'azote liquide (2 trabécules, à l'inclusion et après hypoxie/réoxygénation, de 20 patients préconditionnés à distance et 20 patients "placebo").

L'expression de Caspase 3, de Caspase 3 clivée, de PARP et de protéines PARP clivées dans des coupes de tissus sera détectée par immunohistochimie. Les trabécules seront fixées pendant la nuit dans du formol tamponné neutre à 10 % (tampon phosphate), puis passées dans des solutions graduées d'alcool, traitées trois fois dans du xylène et enfin incluses dans des blocs de paraffine. La documentation des réactions immunohistochimiques sera réalisée avec une caméra SSC-DC58AP (Sony) couplée à un microscope optique Nikon Eclipse E400.

TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transférase dUTP nick and labeling) (2 trabécules, à l'inclusion et après hypoxie/réoxygénation, de 20 patients préconditionnés à distance et 20 patients "placebo").

Les coupes de tissus seront déparaffinées dans 2 changements de xylène pendant 5 minutes chacun et hydratées avec 2 changements d'éthanol à 100 % pendant 3 minutes chacun et d'éthanol à 95 % pendant 1 minute. La documentation des réactions immunohistochimiques sera réalisée avec une caméra SSC-DC58AP (Sony) couplée à un microscope optique Nikon Eclipse E400.

Microscopie électronique (2 trabécules, à l'inclusion et après hypoxie/réoxygénation, chez 10 patients préconditionnés à distance et 10 patients "placebo").

Les trabécules seront placées dans du tampon cacodyl avec 2% de glutaraldéhyde. Les mitochondries seront micrographiées avec le microscope électronique à transmission JEOL-JEM 100CX (JEOL Inc, Peabody, Mass) avec un grossissement x16000. Les micrographies électroniques seront ensuite enregistrées et la taille et la structure des mitochondries seront analysées à l'aide du logiciel Image ProPlus (Media Scanalytics).

L'essai in vivo L'opération sera réalisée avec l'utilisation de CPB en normothermie par un chirurgien cardiaque expérimenté. La cardioplégie antérograde intermittente à sang chaud (37 °C) (miniplégie) sera utilisée pour la protection du myocarde. Comme seuls les patients nécessitant au moins 3 pontages coronariens seront recrutés, nous nous attendons à ce que le temps de clampage aortique dure au moins 30 minutes. Après le retrait de la pince transversale, les anastomoses proximales seront réalisées à l'aide d'une pince à morsure latérale. Le patient sera sevré du CPB, l'hémostase sera sécurisée et la poitrine sera fermée sur les drains thoraciques. Juste avant de fermer le thorax, une biopsie coupée à l'aiguille 16G du myocarde ventriculaire gauche sera obtenue à partir de la zone de l'apex. Les enquêteurs s'attendent à ce que le temps de reperfusion entre le retrait de la pince croisée et l'obtention de la biopsie dure au moins 40 minutes. Le temps exact d'ischémie (cross-clamp) et le temps de reperfusion (jusqu'à l'obtention de la biopsie) seront mesurés.

Les biopsies myocardiques seront récoltées et évaluées de la même manière que la trabécule auriculaire. Les enquêteurs effectueront au hasard un Western blot dans 60 (30:30) biopsies récoltées sur de l'azote liquide, de l'immunohistochimie dont TUNEL dans 40 (20:20) récoltées sur du formol tamponné neutre à 10%, et de la microscopie électronique dans 20 (10:10) récoltées sur tampon cacodyle avec 2% de glutaraldéhyde. Les méthodes d'évaluation de Caspase3, de Caspase 3 clivée, de PARP, de PARP clivée, de TUNEL et de mitochondries ont été décrites ci-dessus.

Après l'opération, le patient sera transféré aux soins intensifs et traité selon la routine.

Le critère principal d'observation clinique sera la libération postopératoire de troponine cardiaque T.

Les enquêteurs mesureront la concentration sérique de troponine T cardiaque (électrochimiluminescence "ECLIA", Roche) avant l'opération et 72h après le retrait de la pince croisée. En même temps, le niveau de l'isoenzyme MB de créatine kinase sera évalué (dosage enzymatique, Roche). L'aire sous la courbe du niveau du marqueur dans le temps sera comparée entre les groupes.

Pour évaluer la fonction myocardique, tous les patients auront un cathéter artériel pulmonaire (cathéter de Swan Ganz) inséré en préopératoire. Une évaluation hémodynamique complète (méthode de thermodilution) ainsi que l'état du métabolisme de l'oxygène basé sur l'analyse des gaz artériels et veineux mixtes seront effectués avant l'opération et 48 heures après le retrait du clamp aortique.

Outre la mesure de l'indice cardiaque, nous calculerons les indices de travail cardiaque gauche et droit. L'indice d'apport d'oxygène et le taux d'extraction seront calculés. Les niveaux de lactate seront également mesurés. Les enquêteurs évalueront également la nécessité d'un support inotrope aux mêmes moments en utilisant ce que l'on appelle l'indice inotrope.

Tous les patients auront un électrocardiogramme postopératoire les jours 2 et 4 selon la routine de soins postopératoires et en plus le 1er jour après l'opération. De même, d'autres tests postopératoires de routine qui sont effectués dans le cadre des soins postopératoires de routine seront effectués, surveillés et utilisés pour rechercher les différences dans l'évolution postopératoire. Cela comprend l'échocardiographie ainsi que la créatinine (eGFR).