Vzdálená ischemická preconditioning lidského myokardu

Vyšetřovatelé budou studovat:

1. Odolnost izolovaných trabekul pektinátového svalu pravé síně vůči simulované hypoxii/reperfuzi ve funkčním modelu orgánové lázně
2. Odolnost izolovaných trámčin pektinátového svalu pravé síně vůči indukci apoptózy simulovanou hypoxií/reperfuzí
3. Odolnost mitochondrií v izolovaných trabekulách pektinátového svalu pravé síně vůči změnám vyvolaným simulovanou hypoxií/reperfuzí

Zároveň budeme posuzovat:

1. Množství nekrózy myokardu in vivo vyvolané obdobím ischemie a reperfuze během bypassu koronární artérie (CABG) hodnocené profilem uvolňování markerů pooperační nekrózy myokardu
2. Funkce myokardu in vivo po období ischemie a reperfuze během CABG hodnocená hemodynamickými měřeními (termodiluční metoda), požadavky na dodávku/spotřebu kyslíku a požadavky na inotropní podporu
3. Indukce apoptózy a stav mitochondrií po období ischemie a reperfuze během CABG, jak bylo hodnoceno v biopsiích myokardu levé komory Výzkumníci se pokusí korelovat in vitro a in vivo nálezy od stejných pacientů.

Metodologie Studie bude provedena in vivo i ex vivo. Pacienti odeslaní na CABG pro stabilní ischemickou chorobu srdeční budou vybráni a randomizováni (1:1) pomocí generátoru náhodných číslic do jedné ze dvou skupin: vzdálené předkondicionování nebo „placebo“ intervence. Zařazeni budou pouze pacienti, u kterých jsou plánovány alespoň 3 bypassy koronárních tepen s použitím kardiopulmonálního bypassu (CPB). V den operace, po úvodu do anestezie a před kožní incizí bude vyvolána vzdálená předkondicionace. Skupina "placebo" bude mít tlakovou manžetu umístěnou na pravé paži, ale nebude prováděno žádné nafukování. Aby se dosáhlo oslepení, nafouknutí bude probíhat pod chirurgickými rouškami a bude je provádět pokaždé stejná osoba, která se bude podílet na generování náhodných sekvencí a aplikaci předkondicionování na dálku, ale ne v péči o pacienta nebo v jiném souvisejícím výzkumu. úkoly.

Všem schváleným pacientům bude v rámci jejich rutinní předoperační péče provedena předoperační echokardiografie, elektrokardiografie a krevní testy včetně hloupého krevního obrazu, kreatininu, BUN a jaterních testů. Dále budou hodnoceny hladiny troponinu T a CK-MB. Dále bude pacientům provedeno elektrokardiografické vyšetření 1. den po operaci.

Anestezie bude standardizována a bude sestávat z midazolamu 15 mg perorálně 1 hodinu před operací, etomidátu 0,2 mg/kg, fentanylu 5 g/kg a pankuronia 0,1 mg/kg iv pro indukci anestezie, propofol 0,5-1,0 mg/kg/h a fentanyl 4g/kg/h infuze pro udržení anestezie. Nebudou použity žádné anestetické plyny. S katétrem Swan-Ganz bude použito plné hemodynamické monitorování (není rutinní u pacientů s CABG). Předoperačně budou provedena první hemodynamická měření a výpočty dodávky/spotřeby kyslíku.

Funkční hodnocení in vitro. Při kanylaci pro CPB se všem pacientům odebere ouška pravé síně, která se běžně odstraňuje a vyhazuje pro zavedení žilní kanyly. Tkáň bude přenesena v ledově studeném Krebs-Henseleitově roztoku do izolované orgánové laboratoře na našem oddělení. Pro základní hodnocení apoptózy nebo mitochondrií (viz níže) bude odebrána jedna trámčina pektinátového svalu. Další jednotlivá trabekula o průměru menším než 1 mm bude namontována do varhanní komory – Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Německo (HSE)) obsahující Krebs-Henseleitův roztok. Bude okysličován přes skleněnou fritu s karbogenem (95% kyslík, 5% oxid uhličitý) a udržován na 37°C. Trabekula bude poháněna čtvercovými stimuly 1Hz 50ms pomocí elektrod s platinovým polem a potenciálem 150% prahu pro daný preparát. Bude použit stimulátor typu 215 (HSE). Síla kontrakce bude měřena izometrickým snímačem síly F30 typu 372 (HSE). Signál bude posílen modulem zesilovače převodníku TAM A PlagSYS Type705 (HSE) a zaznamenán pomocí systému PowerLab/4SP a softwaru Chart (AD Instruments).

Trabekula bude postupně natažena na 90 % optimálního napětí podle Frank-Starlingova vztahu a ponechána po dobu 30 minut stabilizace a vymytí.

60minutová ischemie bude simulována náhradou kyslíku v karbogenu argonem (95% argon, 5% oxid uhličitý) a nahrazením Krebs-Henseleitova roztoku roztokem neobsahujícím glukózu ani pyruvát. Při reoxygenaci se znovu přidá karbogen a roztok tkáňové lázně se nahradí roztokem použitým na začátku. Tkáň bude několikrát promyta a ponechána po dobu 120 minut reoxygenace s promýváním každých 15 minut. Tento funkční model hypoxické reoxygenace byl v naší laboratoři používán již dříve [12-14]. Nahrazení kyslíku argonem má za následek pokles parciálního tlaku kyslíku v tkáňové lázni z 475±52 mmHg na 51±1,8 mmHg (p<0,001) [37-39]. Je doprovázena výrazným a rychlým poklesem izometrické kontrakční síly. Při reoxygenaci se nejprve vrací kontrakční síla a dále pozorujeme pomalý pokles svalového inotropismu, který interpretujeme jako rozvoj reoxygenačního poškození. Nakonec použijeme 10-4 M norepinefrinu ((-)-Arterenol bitartrátu) k testování omračování.

Síla kontrakce bude nepřetržitě zaznamenávána. Kontraktilita bude vyjádřena v procentech počáteční kontrakční síly pro daný přípravek. Výzkumníci budou porovnávat maximální obnovenou kontrakční sílu, kontrakční sílu po 30 minutách a 120 minutách reoxygenace a kontrakční sílu vytvořenou přidáním 10-4M norepinefrinu na konci reoxygenace.

Vyšetřovatelé budou také hledat známky rozvoje ischemické kontraktury definované jako zvýšení klidového napětí trabekuly. Toto zvýšení, pokud je přítomno, začíná krátce po nástupu hypoxie a plynule pokračuje po celou dobu hypoxie. Vyšetřovatelé budou porovnávat zvýšení klidového napětí (v mN/mg hmoty tkáně) na konci hypoxie, tedy v době maximální kontraktury.

Všechna měření, a zejména obnovení funkce, budou porovnány mezi trabekulami od vzdáleně předkondicionovaných a "placebových" pacientů.

Dvě síňové trabekuly ze stejného úponu, jedna odebraná na začátku a další podrobená funkčnímu experimentu (60 min hypoxie + 120 min reoxygenace), budou studovány pokaždé pro:

• indukce apoptózy - exprese kaspázy 3 a štěpené kaspázy 3, exprese PARP a štěpené PARP měřená metodou Western-Blot, popř.
• indukce apoptózy - hodnocena pomocí TUNEL a imunohistochemického barvení na kaspázu 3, štěpenou kaspázu 3, PARP a štěpenou PARP, popř.
• stav mitochondrií (elektronová mikroskopie) Protože plánujeme randomizovat 120 pacientů (viz níže), materiál pro studie apoptózy a mitochondrií bude náhodně odebrán od 60 pacientů (30:30) pro Western Blot, 40 pacientů (20:20) pro imunohistochemii a TUNEL a 20 pacientů (10:10) pro elektronovou mikroskopii.

Western blot (2 trabekuly, základní linie a po hypoxii/reoxygenaci, od 30 vzdáleně předkondicionovaných a 30 „placebových“ pacientů).

Pro imunologický test Western Blot budou trabekuly umístěny do imunohistochemie tekutého dusíku (2 trabekuly, základní linie a po hypoxii/reoxygenaci, od 20 vzdáleně předkondicionovaných a 20 „placebových“ pacientů).

Exprese kaspázy 3, štěpené kaspázy 3, PARP a štěpených proteinů PARP v tkáňových řezech bude detekována imunohistochemicky. Trabekuly se fixují přes noc v 10% neutrálně pufrovaném formalínu (fosfátový pufr), následně projdou přes tříděné alkoholové roztoky, zpracují se třikrát v xylenu a nakonec se uloží do parafinových bloků. Dokumentace imunohistochemických reakcí bude provedena kamerou SSC-DC58AP (Sony) spojenou s optickým mikroskopem Nikon Eclipse E400.

TUNEL (terminální deoxynukleotidyltransferáza dUTP nick and labeling) (2 trabekuly, výchozí stav a po hypoxii/reoxygenaci, od 20 vzdáleně předkondicionovaných a 20 „placebových“ pacientů).

Tkáňové řezy budou deparafinizovány ve 2 výměnách xylenu, každý po 5 minutách, a hydratovány 2 výměnami 100% ethanolu po 3 minutách a 95% etanolu po 1 minutu. Dokumentace imunohistochemických reakcí bude provedena kamerou SSC-DC58AP (Sony) spojenou s optickým mikroskopem Nikon Eclipse E400.

Elektronová mikroskopie (2 trabekuly, základní linie a po hypoxii/reoxygenaci, od 10 vzdáleně předkondicionovaných a 10 „placebových“ pacientů).

Trabekuly budou umístěny do kakodylového pufru s 2% glutaraldehydem. Mitochondrie budou mikrografovány transmisním elektronovým mikroskopem JEOL-JEM 100CX (JEOL Inc, Peabody, Mass) se zvětšením x 16000. Elektronové mikrofotografie budou následně uloženy a velikost a struktura mitochondrií budou analyzovány pomocí softwaru Image ProPlus (Media Scanalytics).

Zkouška in vivo Operace bude provedena s použitím CPB při normotermii zkušeným kardiochirurgem. K ochraně myokardu bude použita intermitentní teplokrevná (37°C) antegrádní kardioplegie (miniplegie). Vzhledem k tomu, že budou přijímáni pouze pacienti vyžadující alespoň 3 koronární bypassové štěpy, očekáváme, že doba křížového sevření aorty bude trvat alespoň 30 minut. Po odstranění příčné svorky budou provedeny proximální anastomózy pomocí boční kousací svorky. Pacient bude odstaven z CPB, bude zajištěna hemostáza a hrudník bude uzavřen přes hrudní trubice. Těsně před uzavřením hrudníku bude z oblasti apexu získána biopsie myokardu levé komory s jehlou 16G. Vyšetřovatelé očekávají, že doba reperfuze od odstranění zkřížené svorky do získání biopsie bude trvat alespoň 40 minut. Bude měřena přesná doba ischemie (cross-clamp) a doba reperfuze (do získání biopsie).

Biopsie myokardu budou odebírány a hodnoceny stejným způsobem jako trámčina síní. Vyšetřovatelé náhodně provedou Western blotting u 60 (30:30) biopsií odebraných na kapalném dusíku, imunohistochemii včetně TUNEL ve 40 (20:20) odebraných na 10% neutrálním pufrovaném formalínu a elektronovou mikroskopii u 20 (10:10) odebraných na kakodylový pufr s 2% glutaraldehydem. Způsoby hodnocení kaspázy 3, štěpené kaspázy 3, PARP, štěpené PARP, TUNEL a mitochondrií byly popsány výše.

Po operaci bude pacient převezen na JIP a bude ošetřován běžným způsobem.

Primárním cílem klinického pozorování bude pooperační uvolnění srdečního troponinu T.

Vyšetřovatelé budou měřit sérovou koncentraci srdečního troponinu T (elektrochemiluminiscenční "ECLIA", Roche) před operací a dalších 72 hodin po odstranění zkřížené svorky. Současně bude hodnocena hladina izoenzymu kreatinkinázy MB (enzymatický test, Roche). Mezi skupinami bude porovnána plocha pod křivkou hladiny markeru v čase.

K posouzení funkce myokardu bude všem pacientům předoperačně zaveden katétr do plicnice (katétr Swan Ganz). Předoperačně a dalších 48 hodin po odstranění aortální zkřížené svorky bude provedeno kompletní hemodynamické hodnocení (termodiluční metoda) a také stav kyslíkového metabolismu na základě analýzy arteriálních a smíšených venózních plynů.

Kromě měření srdečního indexu spočítáme levý a pravý srdeční pracovní index. Vypočte se index dodávky kyslíku a poměr extrakce. Bude také měřena hladina laktátu. Vyšetřovatelé také posoudí potřebu inotropní podpory ve stejných časových bodech pomocí tzv. inotropního indexu.

Všichni pacienti budou mít pooperační elektrokardiogram 2. a 4. den podle rutiny pooperační péče a navíc 1. den po operaci. Obdobně budou prováděny, sledovány a využívány další rutinní pooperační testy, které jsou prováděny v rámci běžné pooperační péče, k hledání rozdílů v pooperačním průběhu. To zahrnuje echokardiografii a také kreatinin (eGFR).