Ihmisen sydänlihaksen etäiskeeminen esihoito

Tutkijat tutkivat:

1. Eristettyjen oikean eteisen pektinaattilihasten trabekulien resistenssi simuloidulle hypoksialle/reperfuusiolle toiminnallisessa elinkylpymallissa
2. Eristetyn oikean eteisen pektinaattilihaksen trabekulien vastustuskyky apoptoosin induktiolle simuloidulla hypoksialla/reperfuusiolla
3. Mitokondrioiden resistenssi yksittäisissä oikean eteisen pektinaattilihasten trabekuleissa simuloidun hypoksian/reperfuusion aiheuttamille muutoksille

Samalla arvioimme:

1. Iskemiajakson ja reperfuusion aiheuttama sydänlihasnekroosin määrä in vivo sepelvaltimon ohitusleikkauksen (CABG) aikana määritettynä leikkauksen jälkeisen sydännekroosimarkkerien vapautumisprofiililla
2. Sydänlihaksen toiminta in vivo iskemian ja reperfuusion jälkeen CABG:n aikana hemodynaamisilla mittauksilla (termodiluutiomenetelmä), hapen saannilla/kulutuksella ja inotrooppisen tuen vaatimuksilla arvioituna
3. Apoptoosin induktio ja mitokondrioiden tila iskemian jakson jälkeen ja reperfuusio CABG:n aikana arvioituna vasemman kammion sydänlihasbiopsioissa. Tutkijat yrittävät korreloida samojen potilaiden in vitro- ja in vivo -löydöksiä.

Metodologia Tutkimus suoritetaan sekä in vivo että ex vivo. Potilaat, jotka on lähetetty CABG:hen stabiilin sepelvaltimotaudin vuoksi, rekrytoidaan ja satunnaistetaan (1:1) satunnaislukugeneraattorilla johonkin kahdesta ryhmästä: etähoito tai "plasebo"-interventio. Mukaan otetaan vain potilaat, joille suunnitellaan vähintään 3 sepelvaltimon ohitusleikkausta, joissa käytetään kardiopulmonaalista ohitusta (CPB). Leikkauspäivänä, anestesian induktion jälkeen ja ennen ihon viiltoa, suoritetaan etäkäsittely. "Plasebo"-ryhmän painemansetti asetetaan oikeaan käsivarteen, mutta täyttöjä ei suoriteta. Sokeuttamisen saavuttamiseksi täytökset tapahtuvat leikkausliinojen alla, ja ne suorittaa joka kerta sama henkilö, joka osallistuu satunnaissekvenssin luomiseen ja etäkäsittelyyn, mutta ei potilaan hoitoon tai muuhun tutkimukseen liittyvään tehtäviä.

Kaikille suostumuksen saaneille potilaille tehdään ennen leikkausta kaikukardiografia, elektrokardiografia ja verikokeet, mukaan lukien tyhmäverenkuva, kreatiniini, BUN ja maksan toimintatesti osana heidän rutiininomaista preoperatiivista hoitoaan. Lisäksi troponiini T- ja CK-MB-tasot arvioidaan. Lisäksi potilaille tehdään elektrokardiografia 1. päivänä leikkauksen jälkeen.

Anestesia on standardoitu ja se koostuu midatsolaamista 15 mg suun kautta 1 h ennen leikkausta, etomidaatista 0,2 mg/kg, fentanyylistä 5 g/kg ja pankuroniumista 0,1 mg/kg iv anestesian induktiossa, propofolia 0,5-1,0 mg/kg/h ja fentanyyli 4g/kg/h infuusio anestesian ylläpitoon. Anestesiakaasuja ei käytetä. Täydellistä hemodynaamista seurantaa käytetään Swan-Ganz-katetrin kanssa (ei rutiinia CABG-potilailla). Ensimmäiset hemodynaamiset mittaukset ja hapen saanti/kulutuslaskelmat tehdään ennen leikkausta.

Toiminnallinen in vitro -arviointi. CPB:n kanyloinnin yhteydessä kaikilta potilailta kerätään oikean eteisen lisäosa, joka poistetaan rutiininomaisesti ja hylätään laskimokanyylin asettamista varten. Kudos siirrettiin jääkylmässä Krebs-Henseleit-liuoksessa osastomme eristettyyn elinlaboratorioon. Yksi pektinaattilihaksen trabecula kerätään apoptoosin tai mitokondrioiden perustason arviointia varten (katso alla). Urkukammioon asennetaan toinen yksittäinen trabecula, jonka halkaisija on alle 1 mm - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Saksa (HSE)), joka sisältää Krebs-Henseleit-liuosta. Se hapetetaan lasisulatteen kautta hiilidioksidilla (95 % happea, 5 % hiilidioksidia) ja pidetään 37 °C:ssa. Trabeculaa ohjataan 1 Hz:n 50 ms:n neliöärsykkeillä käyttämällä platinakenttäelektrodeja ja potentiaalia, joka on 150 % tietyn valmisteen kynnysarvosta. Käytetään stimulaattorityyppiä 215 (HSE). Puristusvoima mitataan F30 isometrisellä voimanmuuntimella Type 372 (HSE). Signaalia tehostetaan TAM A PlagSYS -muuntimen vahvistinmoduulilla Type705 (HSE) ja tallennetaan PowerLab/4SP-järjestelmällä ja Chart-ohjelmistolla (AD Instruments).

Trabecula venytetään vähitellen 90 prosenttiin optimaalisesta jännityksestä Frank-Starling-suhteen mukaisesti ja jätetään 30 minuutin stabiloitumiseen ja huuhtoutumiseen.

60 minuutin iskemiaa simuloidaan korvaamalla hiilihappi argonilla (95 % argonia, 5 % hiilidioksidia) ja korvaamalla Krebs-Henseleit-liuos liuoksella, joka ei sisällä glukoosia tai pyruvaattia. Uudelleenhapetuksen yhteydessä hiilivety lisätään uudelleen ja kudoskylpyliuos korvataan aluksi käytetyllä. Kudos pestään useita kertoja ja jätetään 120 minuutin uudelleenhapetusjakson ajaksi ja huuhdellaan 15 minuutin välein. Tätä hypoksian uudelleenhapetuksen toiminnallista mallia on käytetty laboratoriossamme ennen [12-14]. Hapen korvaaminen argonilla johtaa kudoskylvyn hapen osapaineen laskuun 475±52mmHg:stä 51±1,8mmHg:iin (p<0,001) [37-39]. Siihen liittyy merkittävä ja nopea isometrisen supistusvoiman heikkeneminen. Uudelleenhapetuksen aikana supistumisvoima palautuu aluksi ja seuraavaksi havaitaan lihasten inotropismin hidas väheneminen, jonka tulkitsemme uudelleenhapetusvaurion kehittymiseksi. Lopuksi käytämme 10-4 M norepinefriiniä ((-)-Arterenol Bitartrate) tainnutuksen testaamiseen.

Supistumisvoimaa tallennetaan jatkuvasti. Supistumiskyky ilmaistaan ​​prosentteina alkuperäisestä supistumisvoimasta tietyn valmistuksen aikana. Tutkijat vertaavat maksimaalista palautuvaa supistusvoimaa, supistumisvoimaa 30 minuutin ja 120 minuutin uudelleenhapetuksen jälkeen sekä supistusvoimaa, joka syntyy lisäämällä 10-4 M norepinefriiniä uudelleenhapetuksen lopussa.

Tutkijat etsivät myös merkkejä iskeemisestä kontraktuurista, joka määritellään trabeculan lepojännityksen lisääntymisenä. Tämä lisääntyminen, jos sitä esiintyy, alkaa pian hypoksian alkamisen jälkeen ja jatkuu tasaisesti koko hypoksiajakson ajan. Tutkijat vertaavat lepojännityksen lisääntymistä (mN/mg kudosmassaa) hypoksian lopussa, eli maksimaalisen kontraktuurin aikana.

Kaikkia mittauksia ja erityisesti toiminnan palautumista verrataan etäkäsittelyllä esikäsiteltyjen ja "plasebo"-potilaiden trabekulien välillä.

Kahta samasta lisäkkeestä peräisin olevaa eteistrabeculaa, joista toinen on kerätty lähtötilanteessa ja toinen, jolle on tehty toimintakoe (60 min hypoksia + 120 min uudelleenhapetus), tutkitaan joka kerta:

• apoptoosin induktio - Kaspaasi 3 ja pilkottu kaspaasi 3, PARP ja pilkottu PARP ekspressio mitattuna Western-blotilla, tai
• apoptoosin induktio - arvioitu TUNELilla ja immunohistokemiallisella värjäyksellä kaspaasi 3:lle, pilkkoutuneelle kaspaasi 3:lle, PARP:lle ja katkaistulle PARP:lle tai
• mitokondrioiden tila (elektronimikroskooppi) Koska aiomme satunnaistaa 120 potilasta (katso alla), materiaali apoptoosi- ja mitokondriotutkimuksiin otetaan satunnaisesti 60 potilaalta (30:30) Western Blot -tutkimukseen ja 40 potilaalta (20:20) immunohistokemiaan. ja TUNEL, ja 20 potilasta (10:10) elektronimikroskopiaa varten.

Western Blot (2 trabekulaa, lähtötilanne ja hypoksian/uudelleenhapetuksen jälkeen, 30 etäkäsitellyltä ja 30 "plasebo"-potilaalta).

Western blot -immunomääritystä varten trabekulaatit sijoitetaan nestemäiseen typen immunohistokemiaan (2 trabekulaa, lähtötaso ja hypoksian/uudelleenhapetuksen jälkeen, 20 etäkäsitellyltä ja 20 "plasebo"-potilaalta).

Kaspaasi 3:n, katkaistun kaspaasi 3:n, PARP:n ja pilkottujen PARP-proteiinien ilmentyminen kudosleikkeissä havaitaan immunohistokemiallisesti. Trabeculat kiinnitetään yön yli 10-prosenttisessa neutraalisti puskuroidussa formaliinissa (fosfaattipuskuri), kuljetetaan sitten lajiteltujen alkoholiliuosten läpi, käsitellään kolme kertaa ksyleenissä ja upotetaan lopuksi parafiinilohkoihin. Immunohistokemiallisten reaktioiden dokumentointi suoritetaan SSC-DC58AP-kameralla (Sony), joka on yhdistetty Nikon Eclipse E400 -optiseen mikroskooppiin.

TUNEL (terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi dUTP-merkki ja leimaus) (2 trabekulaa, lähtötilanne ja hypoksian/uudelleenhapetuksen jälkeen, 20 etäkäsitellyltä ja 20 "plasebo"-potilaalta).

Kudosleikkeistä parafiini poistetaan kahdella ksyleenin vaihdolla 5 minuutin ajan ja hydratoidaan 2 kertaa 100-prosenttisella etanolilla 3 minuutin ajan ja 95-prosenttisella etanolilla 1 minuutin ajan. Immunohistokemiallisten reaktioiden dokumentointi suoritetaan SSC-DC58AP-kameralla (Sony), joka on yhdistetty Nikon Eclipse E400 -optiseen mikroskooppiin.

Elektronimikroskopia (2 trabekulaa, lähtötilanne ja hypoksian/uudelleenhapetuksen jälkeen, 10 etäkäsitellyltä ja 10 plasebopotilaalta).

Trabeculat sijoitetaan kakodyylipuskuriin, jossa on 2 % glutaraldehydiä. Mitokondriot mikrokuvataan JEOL-JEM 100CX -transmissioelektronimikroskoopilla (JEOL Inc, Peabody, Mass) x16000 suurennuksella. Seuraavaksi elektronimikrokuvat tallennetaan ja mitokondrioiden koko ja rakenne analysoidaan Image ProPlus -ohjelmistolla (Media Scanalytics).

In vivo -koe Kokenut sydänkirurgi suorittaa leikkauksen käyttämällä CPB:tä normotermiassa. Sydänlihaksen suojaamiseen käytetään ajoittaista lämminveristä (37°C) antegradista kardioplegiaa (miniplegiaa). Koska palvelukseen otetaan vain potilaat, jotka tarvitsevat vähintään 3 sepelvaltimon ohitusleikkausta, odotamme aortan poikkileikkausajan kestävän vähintään 30 minuuttia. Ristipuristimen poistamisen jälkeen proksimaaliset anastomoosit suoritetaan käyttämällä sivupuristuspuristinta. Potilas vieroitettuna CPB:stä, hemostaasi varmistetaan ja rintakehä suljetaan rintaputkien päälle. Juuri ennen rintakehän sulkemista otetaan 16G neulalla leikattu biopsia vasemman kammion sydänlihaksesta kärjen alueelta. Tutkijat odottavat, että reperfuusioaika ristikiinnittimen poistamisesta biopsian ottoon kestää vähintään 40 minuuttia. Tarkka iskemia-aika (ristikiinnitys) ja reperfuusioaika (biopsian saamiseen asti) mitataan.

Sydänlihaskoepalat otetaan talteen ja arvioidaan samalla tavalla kuin eteistrabekuli. Tutkijat suorittavat satunnaisesti Western blottingin 60 (30:30) biopsiasta, jotka on kerätty nestemäisellä typellä, immunohistokemian, mukaan lukien TUNEL, 40 (20:20) näytteessä, jotka on kerätty 10 % neutraalilla puskuroidulla formaliinilla, ja elektronimikroskopian 20 (10:10) näytteestä, jotka on kerätty kakodyylipuskuri, jossa on 2 % glutaraldehydiä. Kaspaasi3:n, katkaistun kaspaasi 3:n, PARP:n, katkaistun PARP:n, TUNELin ja mitokondrioiden arviointimenetelmät on kuvattu edellä.

Leikkauksen jälkeen potilas siirretään teho-osastolle ja hoidetaan rutiinin mukaan.

Kliinisen havainnoinnin ensisijainen päätepiste on sydämen troponiini T:n postoperatiivinen vapautuminen.

Tutkijat mittaavat sydämen troponiini T:n seerumipitoisuutta (elektrokemiluminesenssi "ECLIA", Roche) ennen leikkausta ja seuraavat 72 tuntia ristikiinnittimen poistamisen jälkeen. Samanaikaisesti arvioidaan kreatiinikinaasi-isoentsyymin MB taso (entsymaattinen määritys, Roche). Markkeritason käyrän alla olevaa pinta-alaa ajan mittaan verrataan ryhmien välillä.

Sydänlihaksen toiminnan arvioimiseksi kaikille potilaille asetetaan keuhkovaltimon katetri (Swan Ganz -katetri) ennen leikkausta. Täydellinen hemodynaaminen arviointi (termodiluutiomenetelmä) sekä happiaineenvaihdunnan tila valtimo- ja sekalaskimokaasuanalyysin perusteella tehdään ennen leikkausta ja seuraavan 48 tunnin kuluttua aortan poikkipuristimen poistamisesta.

Sydänindeksin mittaamisen lisäksi laskemme vasemman ja oikean sydämen työindeksit. Hapen toimitusindeksi ja uuttosuhde lasketaan. Myös laktaattitasot mitataan. Tutkijat arvioivat myös inotrooppisen tuen tarpeen samaan aikaan ns. inotrooppisen indeksin avulla.

Kaikille potilaille tehdään postoperatiivinen elektrokardiogrammi päivänä 2 ja 4 postoperatiivisen hoitorutiinin mukaisesti ja lisäksi 1. päivänä leikkauksen jälkeen. Samoin tehdään muita rutiininomaisia ​​postoperatiivisia testejä, jotka tehdään osana rutiininomaista postoperatiivista hoitoa, ja niitä seurataan ja niiden avulla etsitään eroja postoperatiivisessa kulussa. Tämä sisältää kaikukardiografian sekä kreatiniinin (eGFR).