ヒト心筋のリモート虚血プレコンディショニング

研究者は以下を研究します：

1. 機能臓器浴モデルにおけるシミュレートされた低酸素/再灌流に対する分離された右心房の櫛状筋小柱の抵抗
2. シミュレートされた低酸素/再灌流によるアポトーシスの誘導に対する単離された右心房の櫛状筋小柱の抵抗性
3. シミュレートされた低酸素/再灌流によって誘発される変化に対する単離された右心房の櫛状筋小柱におけるミトコンドリアの耐性

同時に、以下を評価します。

1. 術後の心筋壊死マーカー放出プロファイルによって評価される、冠動脈バイパス移植（CABG）中の虚血および再灌流の期間によって誘発される in vivo での心筋壊死の量
2. 血行力学的測定（熱希釈法）、酸素供給/消費および強心サポート要件によって評価される、CABG中の虚血および再灌流の期間後のin vivoでの心筋機能
3. 虚血期間後のミトコンドリアのアポトーシスと状態の誘導、および左心室心筋生検で評価された CABG 中の再灌流

方法論 この研究は、in vivo と ex-vivo の両方で実施さ​​れます。 安定した冠状動脈疾患のために CABG に紹介された患者は、リモート プレコンディショニングまたは「プラセボ」介入の 2 つのグループのいずれかに、乱数発生器によって募集および無作為化 (1:1) されます。 心肺バイパス (CPB) を使用した少なくとも 3 つの冠動脈バイパス グラフトが計画されている患者のみが含まれます。 手術当日、麻酔導入後、皮膚切開前にリモートプレコンディショニングが行われます。 「プラセボ」グループは、右腕に加圧カフを装着しますが、膨張は行いません。 盲検を得るために、膨張は外科用ドレープの下で行われ、毎回同じ人によって実行されます。この人は、ランダムなシーケンスの生成とリモートのプレコンディショニングの適用に関与しますが、患者のケアやその他の研究に関連するものではありません。タスク。

同意を得たすべての患者は、術前の心エコー検査、心電図検査、およびフール血球数、クレアチニン、BUN、肝機能検査などの血液検査を定期的な術前ケアの一環として実施します。 さらに、トロポニン T と CK-MB レベルが評価されます。 さらに、患者は手術後 1 日目に心電図検査を行います。

麻酔は標準化され、手術の1時間前に経口でミダゾラム15mg、麻酔導入のためにエトミデート0.2mg/kg、フェンタニル5g/kg、パンクロニウム0.1mg/kg iv、プロポフォール0.5-1.0で構成されます。 麻酔維持のための mg/kg/h およびフェンタニル 4g/kg/h の注入。 麻酔ガスは使用しません。 完全な血行動態モニタリングは、Swan-Ganz カテーテルで使用されます (CABG 患者ではルーチンではありません)。 最初の血行動態測定と酸素供給/消費の計算は、術前に実行されます。

機能の in vitro 評価。 CPBのカニューレ挿入では、静脈カニューレの配置のために定期的に除去および廃棄される右心耳がすべての患者から採取されます。 組織は、氷冷クレブス-ヘンゼライト溶液で当科の隔離臓器研究室に移されます。 アポトーシスまたはミトコンドリアのベースライン評価のために、1つの櫛状筋小柱を採取します(下記参照)。 直径 1 mm 未満の別の単一の小柱がオルガン チャンバーに取り付けられます - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik、March-Hugstetten、ドイツ (HSE)) を含む Krebs-Henseleit ソリューション。 カーボゲン（酸素95％、二酸化炭素5％）を含むガラスフリットを介して酸素化され、37°C​​に維持されます。 小柱は、プラチナ フィールド電極と所定の準備のしきい値の 150% の電位を使用して 1 Hz 50 ms 正方形の刺激で駆動されます。 刺激装置タイプ 215 (HSE) が使用されます。 収縮力は、F30 アイソメトリック フォース トランスデューサー タイプ 372 (HSE) で測定されます。 信号は、TAM A PlagSYS トランスデューサ増幅器モジュール Type705 (HSE) で強化され、PowerLab/4SP システムと Chart ソフトウェア (AD Instruments) を使用して記録されます。

Frank-Starling の関係に従って、小柱を最適な張力の 90% まで徐々に伸ばし、30 分間放置して安定させて洗い流します。

カーボゲン中の酸素をアルゴン(95%アルゴン、5%二酸化炭素)で置換し、クレブス・ヘンゼライト溶液をグルコースまたはピルビン酸を含まないものと置換することにより、60分間の虚血をシミュレートする。 再酸素化では、カルボゲンが再び追加され、組織浴溶液が最初に使用されたものに置き換えられます。 組織を数回洗浄し、15分ごとに洗い流しながら120分間の再酸素化期間放置した。 低酸素再酸素化のこの機能モデルは、[12-14] 以前に私たちの研究室で使用されています。 酸素をアルゴンで置換すると、ティッシュバスの酸素分圧が 475±52mmHg から 51±1.8mmHg に低下します (p<0.001) [37-39]。 これには、等尺性収縮力の大幅かつ急速な低下が伴います。 再酸素化の間、収縮力は最初に戻り、次に、再酸素化損傷の発生と解釈される筋肉変力作用のゆっくりとした低下が観察されます。 最後に、10-4 M ノルエピネフリン ((-)-Arterenol Bitartrate) を使用して気絶をテストします。

収縮力は連続的に記録されます。 収縮性は、所定の準備に対する初期収縮力のパーセントで表されます。 研究者は、最大回復収縮力、再酸素化の 30 分後と 120 分後の収縮力、および再酸素化の最後に 10-4M ノルエピネフリンを追加することによって生成される収縮力を比較します。

調査員はまた、小柱の静止張力の増加として定義される虚血性拘縮の兆候を探します。 この増加は、存在する場合、低酸素症の発症直後に始まり、低酸素症期間全体を通じて着実に続きます。 研究者は、低酸素状態の終了時、つまり最大拘縮時の安静時張力 (mN/mg 組織質量) の増加を比較します。

すべての測定値、特に機能の回復は、リモートで事前調整された患者と「プラセボ」患者の小柱間で比較されます。

1 つはベースラインで採取され、もう 1 つは機能実験 (60 分間の低酸素 + 120 分間の再酸素化) にかけられた、同じ付属肢からの 2 つの心房小柱を、次のように毎回研究します。

• アポトーシス誘導 - カスパーゼ 3 および切断されたカスパーゼ 3、PARP および切断された PARP の発現をウエスタンブロットで測定、または
• アポトーシス誘導 - カスパーゼ 3、切断されたカスパーゼ 3、PARP および切断された PARP の TUNEL および免疫組織化学染色で評価、または
• ミトコンドリアの状態 (電子顕微鏡) 120 人の患者を無作為化することを計画しているため (以下を参照)、アポトーシスおよびミトコンドリア研究の材料は、ウエスタンブロット用に 60 人の患者 (30:30)、免疫組織化学用に 40 人の患者 (20:20) から無作為に採取されます。およびTUNEL、および電子顕微鏡検査用の20人の患者（10:10）。

ウェスタンブロット (2 つの小柱、ベースライン、および低酸素/再酸素化後、30 人の遠隔前処理患者および 30 人の「プラセボ」患者から)。

ウエスタンブロットイムノアッセイでは、小柱を液体窒素免疫組織化学に入れる(20個の小柱、ベースラインおよび低酸素/再酸素化後、20名の遠隔前調整患者および20名の「プラセボ」患者から)。

組織切片におけるカスパーゼ 3、切断されたカスパーゼ 3、PARP、および切断された PARP タンパク質の発現は、免疫組織化学的に検出されます。 小柱は、10% 中性緩衝ホルマリン (リン酸緩衝液) で一晩固定され、その後段階的アルコール溶液を通過し、キシレンで 3 回処理され、最後にパラフィン ブロックに埋め込まれます。 免疫組織化学反応の記録は、SSC-DC58AP カメラ (Sony) と Nikon Eclipse E400 光学顕微鏡を組み合わせて実行されます。

TUNEL (ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ dUTP ニックおよびラベリング) (2 つの小柱、ベースラインおよび低酸素/再酸素化後、20 人の遠隔前処理患者および 20 人の「プラセボ」患者から)。

組織切片は、キシレンを 2 回交換して各 5 分間脱パラフィンし、100% エタノールを 2 回交換して各 3 分間、95% エタノールで 1 分間水和します。 免疫組織化学反応の記録は、SSC-DC58AP カメラ (Sony) と Nikon Eclipse E400 光学顕微鏡を組み合わせて実行されます。

電子顕微鏡検査 (2 つの骨梁、ベースライン、および低酸素/再酸素化後、10 人の遠隔前処理患者および 10 人の「プラセボ」患者から)。

骨梁は、2% グルタルアルデヒドを含むカコジル バッファーに配置されます。 ミトコンドリアは、ＪＥＯＬ－ＪＥＭ １００ＣＸ透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ Ｉｎｃ、Ｐｅａｂｏｄｙ、Ｍａｓｓ）で１６０００倍の倍率で顕微鏡写真を撮る。 次に電子顕微鏡写真を保存し、Image ProPlus ソフトウェア (Media Scanalytics) を使用してミトコンドリアのサイズと構造を分析します。

インビボ試験 手術は、経験豊富な心臓外科医によって正常体温で CPB を使用して行われます。 断続的な温血 (37°C) 順行性心臓麻痺 (小麻痺) は、心筋保護のために使用されます。 少なくとも 3 つの冠動脈バイパス グラフトを必要とする患者のみが募集されるため、大動脈クロスクランプ時間は少なくとも 30 分続くと予想されます。 クロス クランプを取り外した後、サイド バイティング クランプを使用して近位吻合を行います。 患者はCPBから引き離され、止血が確保され、胸部が胸管で閉じられます。 胸部を閉じる直前に、左心室心筋の 16G ニードル トゥルー カット生検を心尖領域から取得します。 調査官は、クロスクランプの除去から生検を取得するまでの再灌流時間が少なくとも40分続くと予想しています。 正確な虚血 (クロスクランプ) 時間と再灌流時間 (生検が得られるまで) が測定されます。

心筋生検を採取し、心房小柱と同じ方法で評価します。 研究者は、液体窒素で採取された 60 (30:30) の生検でウエスタンブロット法、10% 中性緩衝ホルマリンで採取された 40 (20:20) で採取された TUNEL を含む免疫組織化学、および 20 (10:10) で採取された電子顕微鏡検査を無作為に実行します。 2％グルタルアルデヒドを含むカコジル緩衝液。 カスパーゼ３、切断されたカスパーゼ３、ＰＡＲＰ、切断されたＰＡＲＰ、ＴＵＮＥＬおよびミトコンドリアを評価する方法は、上に記載されている。

手術後はICUに移され、通常通りの治療が行われます。

臨床観察の主要評価項目は、術後の心筋トロポニン T の放出です。

治験責任医師は、心臓トロポニン T (電気化学発光「ECLIA」、Roche) の血清濃度を術前およびクロスクランプ除去から 72 時間後に測定します。 同時に、クレアチンキナーゼアイソザイムMBのレベルを評価します（酵素アッセイ、Roche）。 経時的なマーカー レベルの曲線下の領域は、グループ間で比較されます。

心筋機能を評価するために、すべての患者に肺動脈カテーテル（スワンガンツカテーテル）が術前に挿入されます。 完全な血行力学的評価（熱希釈法）と、動脈および混合静脈ガス分析に基づく酸素代謝状態が、術前および大動脈クロスクランプ除去の48時間後に実行されます。

心臓指数の測定とは別に、左右の心臓仕事指数を計算します。 酸素運搬指数と抽出率が計算されます。 乳酸値も測定します。 研究者はまた、いわゆる強心指数を使用して、同じ時点で強心サポートの必要性を評価します。

すべての患者は、術後ケアルーチンに従って2日目と4日目に、さらに手術後1日目に術後心電図を取得します。 同様に、通常の術後ケアの一環として実施されるその他の通常の術後検査が実施され、監視され、術後経過の違いを探すために使用されます。 これには、心エコー検査とクレアチニン (eGFR) が含まれます。