Fjärrstyrd ischemisk förkonditionering av humant myokardium

Utredarna kommer att studera:

1. Motstånd hos isolerade högerförmaks pektinatmuskeltrabeculae mot simulerad hypoxi/reperfusion i funktionell organbadmodell
2. Resistens hos isolerade pektinatmuskeltrabeculae i höger förmak mot induktion av apoptos genom simulerad hypoxi/reperfusion
3. Motstånd hos mitokondrier i isolerade högerförmaks pektinatmuskeltrabeculae mot förändringar inducerade av simulerad hypoxi/reperfusion

Samtidigt kommer vi att bedöma:

1. Mängden myokardnekros in vivo inducerad av period av ischemi och reperfusion under kranskärlsbypasstransplantation (CABG) bedömd av postoperativ myokardnekrosmarkörs frisättningsprofil
2. Myokardfunktion in vivo efter perioden med ischemi och reperfusion under CABG, utvärderad genom hemodynamiska mätningar (termodilutionsmetod), syretillförsel/förbrukning och behov av inotropt stöd
3. Induktion av apoptos och status för mitokondrier efter ischemiperioden, och reperfusion under CABG, bedömt i vänsterkammarmyokardbiopsier. Utredarna kommer att försöka korrelera in vitro- och in vivo-fynden från samma patienter.

Metod Studien kommer att genomföras både in vivo och ex-vivo. Patienter som remitteras till CABG för stabil kranskärlssjukdom kommer att rekryteras och randomiseras (1:1) genom slumpmässig siffrorsgenerator till en av två grupper: fjärrkonditionering eller "placebo"-intervention. Endast patienter där minst 3 kranskärlsbypass-transplantationer med användning av kardiopulmonell bypass (CPB) planeras kommer att inkluderas. På operationsdagen, efter induktion av anestesi och före hudsnittet kommer fjärrkonditionering att framkallas. "Placebo"-gruppen kommer att ha tryckmanschetten placerad på höger arm men inga uppblåsningar kommer att utföras. För att få bländning kommer uppblåsningarna att ske under kirurgiska draperier och kommer att utföras av samma person varje gång, som kommer att vara involverad i slumpmässig sekvensgenerering och fjärrkonditionering, men inte i patientens vård eller annan forskningsrelaterad uppgifter.

Alla patienter med samtycke kommer att få preoperativ ekokardiografi, elektrokardiografi och blodprov inklusive blodvärde, kreatinin, BUN och leverfunktionstest som en del av deras rutinmässiga preoperativa vård. Dessutom kommer nivåerna av troponin T och CK-MB att bedömas. Vidare kommer patienter att ha utfört elektrokardiografi den första dagen efter operationen.

Anestesi kommer att vara standardiserad och bestå av midazolam 15mg oralt 1h före operation, etomidat 0,2mg/kg, fentanyl 5g/kg och pankuronium 0,1mg/kg iv för anestesiinduktion, propofol 0,5-1,0 mg/kg/h och fentanyl 4g/kg/h infusion för underhåll av anestesi. Inga narkosgaser kommer att användas. Full hemodynamisk övervakning kommer att användas med Swan-Ganz kateter (inte rutin hos CABG-patienter). Första hemodynamiska mätningar och syretillförsel/förbrukningsberäkningar kommer att utföras preoperativt.

Funktionell bedömning in vitro. Vid kanylering för CPB kommer höger förmaksbihang, som rutinmässigt tas bort och kasseras för venös kanylplacering, att skördas hos alla patienter. Vävnaden kommer att överföras i iskall Krebs-Henseleit-lösning till det isolerade organlaboratoriet på vår avdelning. En pektinatmuskeltrabecula kommer att skördas för baslinjebedömning av apoptos eller mitokondrier (se nedan). Ytterligare en trabecula mindre än 1 mm i diameter kommer att monteras i orgelkammaren - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Tyskland (HSE)) som innehåller Krebs-Henseleit-lösning. Den syresätts via glasfritta med karbogen (95 % syre, 5 % koldioxid) och hålls vid 37°C. Trabecula kommer att drivas med 1Hz 50ms kvadratstimuli med hjälp av platinafältelektroder och potentialen på 150% av tröskeln för given förberedelse. Stimulatorn Typ 215 (HSE) kommer att användas. Kontraktionskraften kommer att mätas med F30 isometrisk kraftgivare Typ 372 (HSE). Signalen kommer att förbättras med TAM A PlagSYS omvandlarförstärkarmodul Type705 (HSE) och spelas in med PowerLab/4SP-system och sjökortsmjukvara (AD Instruments).

Trabecula kommer gradvis att sträckas till 90 % av optimal spänning enligt Frank-Starling-förhållandet och lämnas i 30 minuter av stabilisering och uttvättning.

60 min ischemi kommer att simuleras genom att ersätta syre i karbogen med argon (95% argon, 5% koldioxid) och ersätta Krebs-Henseleit-lösning med en lösning som inte innehåller glukos eller pyruvat. Vid reoxygenering kommer karbogen att tillsättas igen och vävnadsbadlösningen kommer att ersättas med en som användes initialt. Vävnaden tvättades flera gånger och lämnades i 120 minuters återsyresättningsperiod med tvättning var 15:e minut. Denna funktionella modell för hypoxireoxygenering har använts i vårt laboratorium tidigare [12-14]. Ersättning av syre med argon resulterar i att syrepartialtrycket i vävnadsbadet sjunker från 475±52 mmHg till 51±1,8 mmHg (p<0,001) [37-39]. Det åtföljs av betydande och snabb nedgång i isometrisk kontraktionskraft. Under reoxygenering återkommer sammandragningskraften initialt och därefter observerar vi långsam minskning av muskelinotropism, vilket vi tolkar som utveckling av reoxygenationsskada. I slutet kommer vi att använda 10-4 M noradrenalin ((-)-Arterenol Bitartrate) för att testa för bedövning.

Sammandragningskraften kommer att registreras kontinuerligt. Kontraktiliteten kommer att uttryckas i procent av den initiala sammandragningskraften för given förberedelse. Utredarna kommer att jämföra den maximala återvunna kontraktionskraften, kontraktionskraften efter 30 minuter och 120 minuter av återsyresättning och sammandragningskraften som produceras genom att tillsätta 10-4M noradrenalin i slutet av återsyresättningen.

Utredarna kommer också att leta efter tecken på ischemisk kontrakturutveckling definierad som en ökning av vilospänningen i trabecula. Denna ökning, om den är närvarande, börjar strax efter hypoxis början och fortsätter stadigt under hela hypoxiperioden. Utredarna kommer att jämföra ökningen av vilospänning (i mN/mg vävnadsmassa) vid slutet av hypoxi, det vill säga vid tidpunkten för maximal kontraktur.

Alla mätningar, och i synnerhet återhämtning av funktion, kommer att jämföras mellan trabekler från fjärrkonditionerade och "placebo"-patienter.

Två förmakstrabeculae från samma bihang, en skördad vid baslinjen och en annan utsatt för funktionsexperiment (60 min hypoxi + 120 min reoxygenation) kommer att studeras varje gång för:

• apoptosinduktion - kaspas 3 och klyvd kaspas 3, PARP och klyvd PARP uttryck mätt med Western-Blot, eller
• apoptosinduktion - bedömd med TUNEL och immunhistokemifärgning för kaspas 3, klyvd kaspas 3, PARP och klyvd PARP, eller
• mitokondriernas tillstånd (elektronmikroskopi) Eftersom vi planerar att randomisera 120 patienter (se nedan) kommer materialet för apoptos- och mitokondrierstudier att tas slumpmässigt från 60 patienter (30:30) för Western Blot, 40 patienter (20:20) för immunhistokemi och TUNEL, och 20 patienter (10:10) för elektronmikroskopi.

Western Blot (2 trabeculae, baseline och efter hypoxi/reoxygenation, från 30 fjärrkonditionerade och 30 "placebo"-patienter).

För Western Blot-immunanalys kommer trabeklerna att placeras i flytande kväve-immunhistokemi (2 trabeculae, baseline och efter hypoxi/reoxygenation, från 20 fjärrkonditionerade och 20 "placebo"-patienter).

Uttryck av kaspas 3, klyvt kaspas 3, PARP och kluvna PARP-proteiner i vävnadssnitt kommer att detekteras immunhistokemiskt. Trabeculae fixeras över natten i 10 % neutralbuffrat formalin (fosfatbuffert), passeras därefter genom graderade alkohollösningar, bearbetas tre gånger i xylen och slutligen inbäddas i paraffinblock. Dokumentationen av immunhistokemiska reaktioner kommer att utföras med SSC-DC58AP-kamera (Sony) i kombination med Nikon Eclipse E400 optiskt mikroskop.

TUNEL (terminalt deoxinukleotidyltransferas dUTP nick och märkning) (2 trabeculae, baseline och efter hypoxi/reoxygenation, från 20 fjärrkonditionerade och 20 "placebo"-patienter).

Vävnadssektioner kommer att avparaffineras i 2 byten av xylen i 5 minuter vardera och hydratiseras med 2 byten av 100 % etanol i 3 minuter vardera och 95 % etanol i 1 minut. Dokumentationen av immunhistokemiska reaktioner kommer att utföras med SSC-DC58AP-kamera (Sony) i kombination med Nikon Eclipse E400 optiskt mikroskop.

Elektronmikroskopi (2 trabeculae, baseline och efter hypoxi/reoxygenation, från 10 fjärrkonditionerade och 10 "placebo"-patienter).

Trabeculae kommer att placeras i kakodylbuffert med 2% glutaraldehyd. Mitokondrierna kommer att mikrograferas med JEOL-JEM 100CX transmissionselektronmikroskop (JEOL Inc, Peabody, Mass) med förstoring x16000. Elektronmikrofotografierna kommer sedan att sparas och mitokondriernas storlek och struktur kommer att analyseras med hjälp av programvaran Image ProPlus (Media Scanalytics).

In vivo-prövningen Operationen kommer att utföras med användning av CPB vid normotermi av erfaren hjärtkirurg. Intermittent varmblods (37°C) antegrad kardioplegi (miniplegi) kommer att användas för myokardiellt skydd. Eftersom endast patienter som kräver minst 3 koronar bypass-transplantat kommer att rekryteras, förväntar vi oss att aorta-korsklämman tar minst 30 minuter. Efter att korsklämman tagits bort kommer de proximala anastomoserna att utföras med hjälp av sidbittklämma. Patienten kommer att avvänjas från CPB, hemostas kommer att säkras och bröstet kommer att stängas över bröstkorgen. Strax före stängning av bröstkorgen kommer 16G nålskärningsbiopsi av det vänstra ventrikulära myokardiet att tas från apexområdet. Utredarna förväntar sig att reperfusionstiden från korsklämmans avlägsnande till att biopsien erhålls ska vara minst 40 minuter. Den exakta tiden för ischemi (korsklämning) och reperfusionstid (tills biopsi erhålls) kommer att mätas.

Myokardbiopsierna kommer att skördas och bedömas på samma sätt som förmakstrabekul. Utredarna kommer slumpmässigt att utföra Western blotting i 60 (30:30) biopsier skördade på flytande kväve, immunhistokemi inklusive TUNEL i 40 (20:20) skördade på 10 % neutralbuffrat formalin, och elektronmikroskopi i 20 (10:10) skördade på cacodylbuffert med 2% glutaraldehyd. Metoderna för att bedöma Caspase3, klyvd kaspas 3, PARP, klyvd PARP, TUNEL och mitokondrier har beskrivits ovan.

Efter operationen kommer patienten att överföras till ICU och behandlas enligt rutin.

Den primära slutpunkten för klinisk observation kommer att vara postoperativ frisättning av hjärttroponin T.

Utredarna kommer att mäta serumkoncentrationen av hjärt-troponin T (elektrokemiluminescens "ECLIA", Roche) preoperativt och nästa 72 timmar efter att korsklämman tagits bort. Samtidigt kommer nivån av kreatinkinasisoenzym MB att bedömas (enzymatisk analys, Roche). Arean under kurvan för markörnivån över tiden kommer att jämföras mellan grupperna.

För att bedöma myokardfunktionen kommer alla patienter att få pulmonell artärkateter (Swan Ganz-kateter) införd preoperativt. Fullständig hemodynamisk bedömning (termodilutionsmetod) samt status för syrgasmetabolism baserat på arteriell och blandad venös gasanalys kommer att utföras preoperativt och nästa 48 timmar efter avlägsnande av aorta-korsklämman.

Förutom att mäta hjärtindex kommer vi att beräkna vänster och höger hjärtarbetsindex. Syreleveransindex och extraktionsförhållande kommer att beräknas. Laktatnivåerna kommer också att mätas. Utredarna kommer också att bedöma behovet av inotropt stöd vid samma tidpunkter med hjälp av så kallat inotropt index.

Alla patienter kommer att ha postoperativt elektrokardiogram dag 2 och 4 enligt postoperativ vårdrutin och dessutom den 1:a dagen efter operationen. På liknande sätt kommer andra rutinmässiga postoperativa tester som utförs som en del av den rutinmässiga postoperativa vården att utföras, övervakas och användas för att leta efter skillnaderna i postoperativt förlopp. Detta inkluderar ekokardiografi såväl som kreatinin (eGFR).