Pré-condicionamento isquêmico remoto do miocárdio humano

Os investigadores estudarão:

1. Resistência das trabéculas isoladas do músculo pectinado do átrio direito à hipóxia/reperfusão simulada em modelo de banho de órgão funcional
2. Resistência das trabéculas isoladas do músculo pectinado do átrio direito à indução de apoptose por hipóxia/reperfusão simulada
3. Resistência de mitocôndrias em trabéculas isoladas de músculo pectinado atrial direito a alterações induzidas por hipóxia/reperfusão simulada

Simultaneamente avaliaremos:

1. Quantidade de necrose miocárdica in vivo induzida por período de isquemia e reperfusão durante cirurgia de revascularização miocárdica (CABG), avaliada pelo perfil de liberação de marcadores de necrose miocárdica pós-operatória
2. Função miocárdica in vivo após o período de isquemia e reperfusão durante a revascularização miocárdica avaliada por medidas hemodinâmicas (método de termodiluição), suprimento/consumo de oxigênio e necessidades de suporte inotrópico
3. Indução de apoptose e estado das mitocôndrias após o período de isquemia e reperfusão durante CABG, conforme avaliado em biópsias miocárdicas do ventrículo esquerdo. Os investigadores tentarão correlacionar os achados in vitro e in vivo dos mesmos pacientes.

Metodologia O estudo será conduzido in vivo e ex-vivo. Os pacientes encaminhados para CABG por doença arterial coronariana estável serão recrutados e randomizados (1:1) por gerador de dígitos aleatórios para um dos dois grupos: pré-condicionamento remoto ou intervenção "placebo". Serão incluídos apenas pacientes em que pelo menos 3 cirurgias de revascularização do miocárdio com uso de circulação extracorpórea (CEC) estejam planejadas. No dia da cirurgia, após a indução da anestesia e antes da incisão da pele, o pré-condicionamento remoto será realizado. O grupo "placebo" terá o manguito de pressão colocado no braço direito, mas nenhuma insuflação será realizada. Para obter o cegamento, as insuflações ocorrerão sob campos cirúrgicos e serão realizadas sempre pela mesma pessoa, que estará envolvida na geração de sequência aleatória e na aplicação de pré-condicionamento remoto, mas não no cuidado do paciente ou em outras pesquisas relacionadas tarefas.

Todos os pacientes consentidos terão ecocardiografia pré-operatória, eletrocardiografia e exames de sangue, incluindo hemograma, creatinina, BUN e teste de função hepática realizados como parte de seus cuidados pré-operatórios de rotina. Além disso, os níveis de troponina T e CK-MB serão avaliados. Além disso, os pacientes terão realizado eletrocardiografia no 1º dia após a operação.

A anestesia será padronizada e consistirá em midazolam 15mg VO 1h antes da cirurgia, etomidato 0,2mg/kg, fentanil 5g/kg e pancurônio 0,1mg/kg iv para indução anestésica, propofol 0,5-1,0 mg/kg/h e infusão de fentanil 4g/kg/h para manutenção da anestesia. Não serão utilizados gases anestésicos. Será utilizada monitorização hemodinâmica completa com cateter de Swan-Ganz (não é rotina em pacientes de CRM). As primeiras medições hemodinâmicas e cálculos de oferta/consumo de oxigênio serão realizados no pré-operatório.

Avaliação funcional in vitro. Na canulação para CEC, o apêndice atrial direito, que é rotineiramente removido e descartado para colocação de cânula venosa, será colhido em todos os pacientes. O tecido será transferido em solução de Krebs-Henseleit gelada para o laboratório de órgãos isolados de nosso departamento. Uma trabécula de músculo pectinado será colhida para avaliação inicial de apoptose ou mitocôndrias (veja abaixo). Outra trabécula única com menos de 1 mm de diâmetro será montada na câmara do órgão - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Alemanha (HSE)) contendo solução de Krebs-Henseleit. Será oxigenado via frita de vidro com carbogênio (95% oxigênio, 5% dióxido de carbono) e mantido a 37°C. As trabéculas serão acionadas com estímulos quadrados de 1Hz 50ms utilizando eletrodos de campo de platina e o potencial de 150% do limiar para determinado preparo. Será utilizado o estimulador Tipo 215 (HSE). A força de contração será medida com transdutor de força isométrica F30 Tipo 372 (HSE). O sinal será aprimorado com o módulo amplificador transdutor TAM A PlagSYS Type705 (HSE) e registrado usando o sistema PowerLab/4SP e o software Chart (AD Instruments).

A trabécula será gradualmente alongada até 90% da tensão ideal de acordo com a relação de Frank-Starling e deixada por 30min de estabilização e washout.

A isquemia de 60 minutos será simulada substituindo o oxigênio no carbogênio por argônio (95% argônio, 5% dióxido de carbono) e substituindo a solução de Krebs-Henseleit por outra sem glicose ou piruvato. Na reoxigenação, o carbogênio será adicionado novamente e a solução de banho de tecido será substituída por uma usada inicialmente. O tecido será lavado várias vezes e deixado por 120min de período de reoxigenação com washout a cada 15min. Este modelo funcional de reoxigenação de hipóxia já foi usado em nosso laboratório antes [12-14]. A substituição de oxigênio por argônio resulta na queda da pressão parcial de oxigênio do banho tecidual de 475±52mmHg para 51±1,8mmHg (p<0,001) [37-39]. É acompanhada por um declínio significativo e rápido na força de contração isométrica. Durante a reoxigenação a força de contração retorna inicialmente e a seguir observamos um declínio lento do inotropismo muscular que interpretamos como desenvolvimento de lesão de reoxigenação. Ao final, usaremos norepinefrina 10-4 M ((-)-Arterenol bitartarato) para testar a insensibilização.

A força de contração será registrada continuamente. A contratilidade será expressa em porcentagem da força de contração inicial para determinada preparação. Os investigadores irão comparar a força de contração máxima recuperada, a força de contração após 30min e 120min de reoxigenação e a força de contração produzida pela adição de norepinefrina 10-4M no final da reoxigenação.

Os investigadores também procurarão sinais de desenvolvimento de contratura isquêmica definida como um aumento da tensão de repouso das trabéculas. Este aumento, se presente, começa logo após o início da hipóxia e continua de forma constante durante todo o período de hipóxia. Os investigadores irão comparar o aumento da tensão de repouso (em mN/mg de massa tecidual) no final da hipóxia, ou seja, no momento da contratura máxima.

Todas as medições, e em particular a recuperação da função, serão comparadas entre trabéculas de pacientes remotamente pré-condicionados e "placebo".

Duas trabéculas atriais do mesmo apêndice, uma coletada na linha de base e outra submetida a experimento funcional (60 min de hipóxia + 120 min de reoxigenação) serão estudadas a cada vez para:

• indução de apoptose - Caspase 3 e Caspase 3 clivada, expressão de PARP e PARP clivada medida com Western-Blot, ou
• indução de apoptose - avaliada com TUNEL e coloração imuno-histoquímica para Caspase 3, Caspase 3 clivada, PARP e PARP clivada, ou
• estado das mitocôndrias (microscopia eletrônica) Como planejamos randomizar 120 pacientes (veja abaixo), o material para estudos de apoptose e mitocôndrias será retirado aleatoriamente de 60 pacientes (30:30) para Western Blot, 40 pacientes (20:20) para imuno-histoquímica e TUNEL, e 20 pacientes (10:10) para microscopia eletrônica.

Western Blot (2 trabéculas, basal e após hipóxia/reoxigenação, de 30 pacientes remotamente pré-condicionados e 30 "placebo").

Para imunoensaio de Western Blot, as trabéculas serão colocadas em imuno-histoquímica de nitrogênio líquido (2 trabéculas, basal e após hipóxia/reoxigenação, de 20 pacientes remotamente pré-condicionados e 20 "placebo").

A expressão de Caspase 3, Caspase 3 clivada, PARP e proteínas PARP clivadas em cortes de tecido serão detectadas por imuno-histoquímica. As trabéculas serão fixadas durante a noite em formol neutro tamponado a 10% (tampão fosfato), posteriormente passadas por soluções graduadas de álcool, processadas três vezes em xileno e finalmente embebidas em blocos de parafina. A documentação das reações imunohistoquímicas será realizada com câmera SSC-DC58AP (Sony) acoplada ao microscópio óptico Nikon Eclipse E400.

TUNEL (desoxinucleotidil transferase terminal dUTP nick and labeling) (2 trabéculas, linha de base e após hipóxia/reoxigenação, de 20 pacientes remotamente pré-condicionados e 20 "placebo").

Os cortes de tecido serão desparafinizados em 2 trocas de xileno por 5 minutos cada, e hidratados com 2 trocas de etanol 100% por 3 minutos cada, e etanol 95% por 1 minuto. A documentação das reações imunohistoquímicas será realizada com câmera SSC-DC58AP (Sony) acoplada ao microscópio óptico Nikon Eclipse E400.

Microscopia eletrônica (2 trabéculas, basal e após hipóxia/reoxigenação, de 10 pacientes remotamente pré-condicionados e 10 "placebo").

As trabéculas serão colocadas em tampão cacodil com glutaraldeído a 2%. As mitocôndrias serão micrografadas com microscópio eletrônico de transmissão JEOL-JEM 100CX (JEOL Inc, Peabody, Mass) com aumento de x16000. As micrografias eletrônicas serão salvas e o tamanho e a estrutura das mitocôndrias serão analisados ​​usando o software Image ProPlus (Media Scanalytics).

O ensaio in vivo A operação será realizada com uso de CEC em normotermia por cirurgião cardíaco experiente. A cardioplegia (miniplegia) anterógrada intermitente a sangue quente (37°C) será utilizada para proteção miocárdica. Como serão recrutados apenas pacientes que requerem pelo menos 3 enxertos de revascularização do miocárdio, esperamos que o tempo de pinçamento aórtico dure pelo menos 30 minutos. Após a remoção da pinça cruzada, as anastomoses proximais serão realizadas com pinça cortante lateral. O paciente será desmamado da CEC, a hemostasia será assegurada e o tórax será fechado sobre tubos torácicos. Pouco antes de fechar o tórax, a biópsia de corte verdadeiro com agulha 16G do miocárdio ventricular esquerdo será obtida da área do ápice. Os investigadores esperam que o tempo de reperfusão desde a remoção do clamp até a obtenção da biópsia dure pelo menos 40 minutos. Será medido o tempo exato de isquemia (pinça cruzada) e de reperfusão (até a obtenção da biópsia).

As biópsias miocárdicas serão colhidas e avaliadas da mesma forma que a trabécula atrial. Os investigadores realizarão Western blotting aleatoriamente em 60 (30:30) biópsias coletadas em nitrogênio líquido, imuno-histoquímica incluindo TUNEL em 40 (20:20) coletadas em formalina tamponada neutra a 10% e microscopia eletrônica em 20 (10:10) coletadas em tampão cacodil com glutaraldeído a 2%. Os métodos de avaliação de Caspase3, Caspase 3 clivada, PARP, PARP clivada, TUNEL e mitocôndrias foram descritos acima.

Após a operação, o paciente será transferido para a UTI e tratado conforme rotina.

O desfecho primário da observação clínica será a liberação pós-operatória de troponina T cardíaca.

Os investigadores medirão a concentração sérica de Troponina T cardíaca (eletroquimioluminescência "ECLIA", Roche) no pré-operatório e 72h após a remoção do clamp. Ao mesmo tempo, o nível de isoenzima MB da creatina quinase será avaliado (ensaio enzimático, Roche). A área sob a curva do nível do marcador ao longo do tempo será comparada entre os grupos.

Para avaliar a função miocárdica, todos os pacientes terão cateter de artéria pulmonar (cateter de Swan Ganz) inserido no pré-operatório. A avaliação hemodinâmica completa (método de termodiluição), bem como o estado do metabolismo de oxigênio com base na análise de gases arteriais e venosos mistos serão realizados no pré-operatório e nas próximas 48 horas após a remoção da pinça aórtica.

Além de medir o índice cardíaco, calcularemos os índices de trabalho cardíaco esquerdo e direito. O índice de fornecimento de oxigênio e a taxa de extração serão calculados. Os níveis de lactato também serão medidos. Os investigadores também avaliarão a necessidade de suporte inotrópico nos mesmos pontos de tempo usando o chamado índice inotrópico.

Todos os pacientes terão eletrocardiograma pós-operatório nos dias 2 e 4 de acordo com a rotina de cuidados pós-operatórios e adicionalmente no 1º dia após a operação. Da mesma forma, outros testes pós-operatórios de rotina que são realizados como parte dos cuidados pós-operatórios de rotina serão realizados, monitorados e usados ​​para procurar diferenças no curso pós-operatório. Isso inclui ecocardiografia, bem como creatinina (eGFR).