人体心肌的远程缺血预处理

研究人员将研究：

1. 分离的右心房梳状肌小梁在功能器官水浴模型中对模拟缺氧/再灌注的抵抗力
2. 分离的右心房梳状肌小梁对模拟缺氧/再灌注诱导细胞凋亡的抵抗力
3. 分离的右心房梳状肌小梁线粒体对模拟缺氧/再灌注引起的变化的抵抗力

同时我们将评估：

1. 通过术后心肌坏死标志物释放曲线评估冠状动脉旁路移植术 (CABG) 期间缺血和再灌注期间诱导的体内心肌坏死量
2. 通过血流动力学测量（热稀释法）、供氧/消耗和正性肌力支持需求评估 CABG 期间缺血和再灌注后的体内心肌功能
3. 在左心室心肌活组织检查中评估的 CABG 期间局部缺血和再灌注后细胞凋亡和线粒体状态的诱导 研究人员将尝试将同一患者的体外和体内发现联系起来。

方法 该研究将在体内和体外进行。 因稳定性冠状动脉疾病而转诊接受 CABG 的患者将被招募并通过随机数字生成器随机分配 (1:1) 到两组之一：远程预处理或“安慰剂”干预。 仅包括计划使用心肺旁路 (CPB) 进行至少 3 次冠状动脉旁路移植术的患者。 手术当天，麻醉诱导后，切皮前进行远程预处理。 “安慰剂”组将在右臂上放置压力袖带，但不进行充气。 为了获得盲法，充气将在手术单下进行，并且每次都由同一个人执行，他们将参与随机序列生成和远程预处理应用，但不在患者护理或其他相关研究中任务。

所有同意的患者都将进行术前超声心动图、心电图和血液检查，包括傻瓜血细胞计数、肌酐、BUN 和肝功能检查，作为其常规术前护理的一部分。 此外，还将评估肌钙蛋白 T 和 CK-MB 水平。 此外，患者将在术后第 1 天进行心电图检查。

麻醉将标准化，包括术前1小时口服咪达唑仑15mg，依托咪酯0.2mg/kg，芬太尼5g/kg和泮库溴铵0.1mg/kg静脉注射麻醉诱导，异丙酚0.5-1.0 mg/kg/h 和芬太尼 4g/kg/h 输注麻醉维持。 不会使用麻醉气体。 全面的血流动力学监测将与 Swan-Ganz 导管一起使用（在 CABG 患者中不是常规监测）。 将在术前进行首次血流动力学测量和氧气供应/消耗计算。

功能性体外评估。 在 CPB 插管时，将在所有患者中收集右心耳，右心耳通常被移除并丢弃以放置静脉插管。 组织将在冰冷的 Krebs-Henseleit 溶液中转移到我们部门的离体器官实验室。 将收获一个梳状肌小梁用于细胞凋亡或线粒体的基线评估（见下文）。 另一个直径小于 1 毫米的单个小梁将安装在器官室 - 舒勒器官浴（Hugo Sachs Elektronik，March-Hugstetten，德国（HSE）），其中包含 Krebs-Henseleit 溶液。 它将通过玻璃料与碳化物（95% 氧气，5% 二氧化碳）充氧并保持在 37°C。 将使用铂场电极和给定准备阈值的 150% 的电位以 1Hz 50ms 方形刺激驱动小梁。 将使用 215 型 (HSE) 刺激器。 收缩力将用 F30 等距力传感器 372 型 (HSE) 测量。 信号将使用 TAM A PlagSYS 传感器放大器模块 Type705 (HSE) 进行增强，并使用 PowerLab/4SP 系统和图表软件 (AD Instruments) 进行记录。

根据 Frank-Starling 关系将小梁逐渐拉伸至最佳张力的 90%，并静置 30 分钟稳定和冲洗。

将通过用氩气（95% 氩气、5% 二氧化碳）代替卡博根中的氧气并用不含葡萄糖或丙酮酸盐的溶液代替 Krebs-Henseleit 溶液来模拟 60 分钟局部缺血。 在重新充氧时，将再次添加卡波金，并将组织浴溶液替换为最初使用的溶液。 将组织洗涤数次并放置 120 分钟的复氧期，每 15 分钟冲洗一次。 这种缺氧复氧的功能模型之前已在我们的实验室中使用 [12-14] 。 用氩气代替氧气导致组织浴氧分压从 475±52mmHg 下降到 51±1.8mmHg (p<0.001) [37-39]。 它伴随着等长收缩力的显着和快速下降。 在复氧过程中，收缩力最初恢复，接下来我们观察到肌肉收缩力缓慢下降，我们将其解释为复氧损伤的发展。 最后用10-4M去甲肾上腺素((-)-Arterenol Bitartrate)进行致昏试验。

将连续记录收缩力。 收缩力将以给定准备的初始收缩力的百分比表示。 研究人员将比较最大恢复收缩力、复氧 30 分钟和 120 分钟后的收缩力以及复氧结束时加入 10-4M 去甲肾上腺素产生的收缩力。

研究人员还将寻找被定义为小梁静息张力增加的缺血性挛缩发展的迹象。 这种增加，如果存在，在缺氧开始后不久开始，并在整个缺氧期间稳定持续。 研究人员将比较缺氧结束时（即最大挛缩时）静息张力的增加（单位为 mN/mg 组织质量）。

所有测量值，特别是功能恢复，将在远程预处理和“安慰剂”患者的小梁之间进行比较。

来自同一附件的两个心房小梁，一个在基线时收获，另一个进行功能实验（60 分钟缺氧 + 120 分钟复氧），每次将研究以下内容：

• 细胞凋亡诱导 - Caspase 3 和裂解的 Caspase 3、PARP 和裂解的 PARP 表达用 Western-Blot 测量，或
• 细胞凋亡诱导 - 用 TUNEL 和免疫组织化学染色评估 Caspase 3、裂解的 Caspase 3、PARP 和裂解的 PARP，或
• 线粒体状态（电子显微镜） 由于我们计划随机抽取 120 名患者（见下文），细胞凋亡和线粒体研究的材料将从 60 名患者 (30:30) 中随机抽取用于 Western Blot，40 名患者 (20:20) 用于免疫组织化学和 TUNEL，以及 20 名患者 (10:10) 进行电子显微镜检查。

蛋白质印迹（2 个小梁，基线和缺氧/复氧后，来自 30 名远程预处理和 30 名“安慰剂”患者）。

对于蛋白质印迹免疫测定，将小梁置于液氮免疫组织化学中（2 个小梁，基线和缺氧/复氧后，来自 20 名远程预处理和 20 名“安慰剂”患者）。

组织切片中半胱天冬酶 3、裂解的半胱天冬酶 3、PARP 和裂解的 PARP 蛋白的表达将通过免疫组织化学检测。 小梁将在 10% 中性缓冲福尔马林（磷酸盐缓冲液）中固定过夜，随后通过分级酒精溶液，在二甲苯中处理 3 次，最后包埋在石蜡块中。 免疫组织化学反应的记录将使用 SSC-DC58AP 相机（索尼）和尼康 Eclipse E400 光学显微镜进行。

TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口和标记）（2 个小梁，基线和缺氧/复氧后，来自 20 名远程预处理和 20 名“安慰剂”患者）。

将组织切片在二甲苯中脱蜡 2 次，每次 5 分钟，并用 2 次 100% 乙醇水化，每次 3 分钟，95% 乙醇水化 1 分钟。 免疫组织化学反应的记录将使用 SSC-DC58AP 相机（索尼）和尼康 Eclipse E400 光学显微镜进行。

电子显微镜（2 个小梁，基线和缺氧/复氧后，来自 10 名远程预处理和 10 名“安慰剂”患者）。

将小梁置于含 2% 戊二醛的二甲胂缓冲液中。 将使用 JEOL-JEM 100CX 透射电子显微镜（JEOL Inc, Peabody, Mass）以 x16000 的放大倍数对线粒体进行显微摄影。 接下来将保存电子显微照片，并使用 Image ProPlus 软件（Media Scanalytics）分析线粒体大小和结构。

体内试验 该手术将由经验丰富的心脏外科医生在正常体温下使用 CPB 进行。 间歇性温血 (37°C) 顺行心脏停搏（小麻痹）将用于心肌保护。 由于只招募需要至少 3 次冠状动脉旁路移植术的患者，我们预计主动脉钳闭时间至少持续 30 分钟。 拆除交叉夹后，将使用侧咬夹进行近端吻合。 患者将脱离 CPB，止血将得到保障，胸部将通过胸管关闭。 就在关闭胸部之前，将从心尖区域获得左心室心肌的 16G 针切活检。 研究人员预计从交叉钳移除到获得活检的再灌注时间至少持续 40 分钟。 将测量确切的缺血（交叉钳）时间和再灌注时间（直到获得活组织检查）。

将以与心房小梁相同的方式采集和评估心肌活检。 研究人员将随机对在液氮上采集的 60 个 (30:30) 活检组织进行免疫印迹，对在 10% 中性缓冲福尔马林中采集的 40 个 (20:20) 进行免疫组化，包括 TUNEL，在 20 个 (10:10) 采集的组织中进行电子显微镜检查含 2% 戊二醛的二甲胂基缓冲液。 评估 Caspase3、裂解的 Caspase 3、PARP、裂解的 PARP、TUNEL 和线粒体的方法如上所述。

手术后患者将被转移到ICU并按常规进行治疗。

临床观察的主要终点是术后心肌肌钙蛋白 T 的释放。

研究人员将在术前和接下来的 72 小时后测量心肌肌钙蛋白 T 的血清浓度（电化学发光“ECLIA”，Roche）。 同时将评估肌酸激酶同工酶 MB 的水平（酶法测定，Roche）。 随时间变化的标记物水平曲线下的面积将在各组之间进行比较。

为了评估心肌功能，所有患者都将在术前插入肺动脉导管（Swan Ganz 导管）。 全面的血液动力学评估（热稀释法）以及基于动脉和混合静脉气体分析的氧代谢状态将在术前和主动脉横钳移除后 48 小时进行。

除了测量心脏指数外，我们还将计算左右心脏做功指数。 将计算氧输送指数和提取率。 还将测量乳酸水平。 研究人员还将使用所谓的正性肌力指数评估在同一时间点对正性肌力支持的需求。

所有患者将在第 2 天和第 4 天按照术后护理常规进行术后心电图检查，并在术后第 1 天进行检查。 类似地，作为常规术后护理的一部分进行的其他常规术后测试将被执行、监测并用于寻找术后过程的差异。 这包括超声心动图和肌酐 (eGFR)。