Preacondicionamiento isquémico remoto del miocardio humano

Los investigadores estudiarán:

1. Resistencia de las trabéculas aisladas del músculo pectinado de la aurícula derecha a la hipoxia/reperfusión simulada en un modelo de baño de órganos funcional
2. Resistencia de las trabéculas aisladas del músculo pectinado de la aurícula derecha a la inducción de apoptosis por hipoxia/reperfusión simulada
3. Resistencia de las mitocondrias en trabéculas aisladas del músculo pectinado auricular derecho a los cambios inducidos por hipoxia/reperfusión simulada

Simultáneamente evaluaremos:

1. Cantidad de necrosis miocárdica in vivo inducida por el período de isquemia y reperfusión durante el injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG) según lo evaluado por el perfil de liberación de marcadores de necrosis miocárdica postoperatoria
2. Función miocárdica in vivo después del período de isquemia y reperfusión durante la CABG evaluada mediante mediciones hemodinámicas (método de termodilución), suministro/consumo de oxígeno y requerimientos de soporte inotrópico
3. Inducción de la apoptosis y estado de las mitocondrias después del período de isquemia y reperfusión durante la CABG evaluada en biopsias de miocardio del ventrículo izquierdo Los investigadores intentarán correlacionar los hallazgos in vitro e in vivo de los mismos pacientes.

Metodología El estudio se llevará a cabo tanto in vivo como ex vivo. Los pacientes referidos para CABG por enfermedad arterial coronaria estable serán reclutados y aleatorizados (1:1) mediante un generador de dígitos aleatorios a uno de dos grupos: preacondicionamiento remoto o intervención "placebo". Solo se incluirán pacientes en los que se planifiquen al menos 3 revascularizaciones coronarias con uso de circulación extracorpórea (CEC). El día de la cirugía, después de la inducción de la anestesia y antes de la incisión en la piel, se obtendrá un preacondicionamiento remoto. Al grupo "placebo" se le colocará el manguito de presión en el brazo derecho, pero no se realizará ningún inflado. Para obtener el cegamiento, los inflados se realizarán bajo paños quirúrgicos y serán realizados por la misma persona cada vez, que participará en la generación de secuencias aleatorias y la aplicación de preacondicionamiento remoto, pero no en el cuidado del paciente ni en otras investigaciones relacionadas. tareas.

Todos los pacientes que hayan dado su consentimiento se someterán a una ecocardiografía, un electrocardiograma y análisis de sangre preoperatorios, incluidos hemograma, creatinina, BUN y pruebas de función hepática, como parte de su atención preoperatoria de rutina. Además, se evaluarán los niveles de troponina T y CK-MB. Además, los pacientes habrán realizado una electrocardiografía el primer día después de la operación.

La anestesia será estandarizada y consistirá en midazolam 15 mg por vía oral 1 h antes de la cirugía, etomidato 0,2 mg/kg, fentanilo 5 g/kg y pancuronio 0,1 mg/kg iv para la inducción de la anestesia, propofol 0,5-1,0 mg/kg/h y fentanilo 4g/kg/h en infusión para mantenimiento anestésico. No se utilizarán gases anestésicos. Se usará un monitoreo hemodinámico completo con catéter Swan-Ganz (no de rutina en pacientes con CABG). Las primeras mediciones hemodinámicas y los cálculos de suministro/consumo de oxígeno se realizarán antes de la operación.

Evaluación funcional in vitro. En la canulación para la CEC, el apéndice auricular derecho, que se extrae y desecha de forma rutinaria para la colocación de la cánula venosa, se recolectará en todos los pacientes. El tejido se transferirá en solución de Krebs-Henseleit helada al laboratorio de órganos aislados de nuestro departamento. Se recolectará una trabécula de músculo pectinado para la evaluación inicial de la apoptosis o las mitocondrias (ver más abajo). Se montará otra trabécula única de menos de 1 mm de diámetro en la cámara del órgano - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Alemania (HSE)) que contiene solución de Krebs-Henseleit. Se oxigenará mediante frita de vidrio con carbógeno (95 % de oxígeno, 5 % de dióxido de carbono) y se mantendrá a 37 °C. La trabécula se impulsará con estímulos cuadrados de 1 Hz y 50 ms utilizando electrodos de campo de platino y el potencial del 150 % del umbral para la preparación dada. Se utilizará el estimulador Tipo 215 (HSE). La fuerza de contracción se medirá con el transductor de fuerza isométrica F30 Tipo 372 (HSE). La señal se mejorará con el módulo amplificador de transductor TAM A PlagSYS Tipo 705 (HSE) y se registrará con el sistema PowerLab/4SP y el software Chart (AD Instruments).

La trabécula se estirará gradualmente hasta el 90 % de la tensión óptima según la relación de Frank-Starling y se dejará durante 30 minutos de estabilización y lavado.

Se simulará una isquemia de 60 min sustituyendo el oxígeno en carbógeno por argón (95 % de argón, 5 % de dióxido de carbono) y reemplazando la solución de Krebs-Henseleit por una que no contenga glucosa ni piruvato. En la reoxigenación, el carbógeno se agregará nuevamente y la solución de baño de tejido se reemplazará con la utilizada inicialmente. El tejido se lavará varias veces y se dejará durante 120 minutos de período de reoxigenación con lavado cada 15 minutos. Este modelo funcional de reoxigenación por hipoxia se ha utilizado en nuestro laboratorio antes [12-14]. El reemplazo de oxígeno con argón da como resultado la caída de la presión parcial de oxígeno del baño tisular de 475±52 mmHg a 51±1,8 mmHg (p<0,001) [37-39]. Se acompaña de una disminución significativa y rápida de la fuerza de contracción isométrica. Durante la reoxigenación, la fuerza de contracción regresa inicialmente y luego observamos una disminución lenta del inotropismo muscular que interpretamos como el desarrollo de una lesión por reoxigenación. Al final, utilizaremos 10-4 M de norepinefrina ((-)-bitartrato de arterenol) para probar el aturdimiento.

La fuerza de contracción se registrará continuamente. La contractilidad se expresará en porcentaje de la fuerza de contracción inicial para una preparación dada. Los investigadores compararán la fuerza de contracción máxima recuperada, la fuerza de contracción después de 30 min y 120 min de reoxigenación y la fuerza de contracción producida al agregar 10-4 M de norepinefrina al final de la reoxigenación.

Los investigadores también buscarán signos de desarrollo de contractura isquémica definida como un aumento de la tensión de reposo de la trabécula. Este aumento, si está presente, comienza poco después del inicio de la hipoxia y continúa de manera constante durante todo el período de hipoxia. Los investigadores compararán el aumento de la tensión en reposo (en mN/mg de masa de tejido) al final de la hipoxia, es decir, en el momento de la contractura máxima.

Todas las mediciones, y en particular la recuperación de la función, se compararán entre trabéculas de pacientes remotamente preacondicionados y pacientes "placebo".

Se estudiarán cada vez dos trabéculas auriculares del mismo apéndice, una extraída al inicio y otra sometida a un experimento funcional (60 min de hipoxia + 120 min de reoxigenación) para:

• inducción de apoptosis - Caspasa 3 y caspasa 3 escindida, PARP y expresión de PARP escindida medida con Western-Blot, o
• inducción de apoptosis: evaluada con TUNEL y tinción inmunohistoquímica para caspasa 3, caspasa 3 escindida, PARP y PARP escindida, o
• estado de las mitocondrias (microscopía electrónica) Como planeamos aleatorizar a 120 pacientes (ver más abajo), el material para los estudios de apoptosis y mitocondrias se tomará aleatoriamente de 60 pacientes (30:30) para Western Blot, 40 pacientes (20:20) para inmunohistoquímica y TUNEL, y 20 pacientes (10:10) para microscopía electrónica.

Western Blot (2 trabéculas, basales y después de hipoxia/reoxigenación, de 30 pacientes preacondicionados remotamente y 30 pacientes "placebo").

Para el inmunoensayo Western Blot, las trabéculas se colocarán en inmunohistoquímica con nitrógeno líquido (2 trabéculas, al inicio y después de la hipoxia/reoxigenación, de 20 pacientes preacondicionados remotamente y 20 pacientes "placebo").

La expresión de caspasa 3, caspasa 3 escindida, PARP y proteínas PARP escindidas en secciones de tejido se detectará inmunohistoquímicamente. Las trabéculas se fijarán durante la noche en formalina tamponada neutra al 10 % (tampón de fosfato), luego se pasarán por soluciones graduadas de alcohol, se procesarán tres veces en xileno y finalmente se incluirán en bloques de parafina. La documentación de las reacciones inmunohistoquímicas se realizará con una cámara SSC-DC58AP (Sony) acoplada a un microscopio óptico Nikon Eclipse E400.

TUNEL (desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP muesca y marcaje) (2 trabéculas, línea base y después de hipoxia/reoxigenación, de 20 pacientes preacondicionados remotamente y 20 pacientes "placebo").

Las secciones de tejido se desparafinizarán en 2 cambios de xileno durante 5 minutos cada uno y se hidratarán con 2 cambios de etanol al 100 % durante 3 minutos cada uno y etanol al 95 % durante 1 minuto. La documentación de las reacciones inmunohistoquímicas se realizará con una cámara SSC-DC58AP (Sony) acoplada a un microscopio óptico Nikon Eclipse E400.

Microscopía electrónica (2 trabéculas, basal y después de hipoxia/reoxigenación, de 10 pacientes preacondicionados remotamente y 10 pacientes "placebo").

Las trabéculas se colocarán en tampón cacodilo con glutaraldehído al 2 %. Las mitocondrias se micrografiarán con un microscopio electrónico de transmisión JEOL-JEM 100CX (JEOL Inc, Peabody, Mass) con un aumento de x16000. A continuación, se guardarán las micrografías electrónicas y se analizará el tamaño y la estructura de las mitocondrias mediante el software Image ProPlus (Media Scanalytics).

El ensayo in vivo La operación se realizará con el uso de CEC en normotermia por un cirujano cardíaco experimentado. La cardioplejía anterógrada (miniplejía) intermitente con sangre caliente (37 °C) se utilizará para la protección del miocardio. Dado que solo se reclutarán pacientes que requieran al menos 3 injertos de derivación coronaria, esperamos que el pinzamiento aórtico dure al menos 30 minutos. Después de retirar la abrazadera cruzada, las anastomosis proximales se realizarán con una abrazadera de mordida lateral. Se desconectará al paciente de la CEC, se asegurará la hemostasia y se cerrará el tórax sobre los tubos torácicos. Justo antes de cerrar el tórax, se obtendrá una biopsia de corte verdadero con aguja 16G del miocardio del ventrículo izquierdo del área del vértice. Los investigadores esperan que el tiempo de reperfusión desde la extracción de la pinza cruzada hasta la obtención de la biopsia dure al menos 40 minutos. Se medirá el tiempo exacto de isquemia (cross-clamp) y el tiempo de reperfusión (hasta la obtención de la biopsia).

Las biopsias de miocardio se recolectarán y evaluarán de la misma manera que la trabécula auricular. Los investigadores realizarán aleatoriamente transferencia Western en 60 (30:30) biopsias recolectadas en nitrógeno líquido, inmunohistoquímica que incluye TUNEL en 40 (20:20) recolectadas en formalina tamponada neutra al 10 % y microscopía electrónica en 20 (10:10) recolectadas en tampón cacodilo con glutaraldehído al 2%. Los métodos de evaluación de Caspase3, Caspase 3 escindida, PARP, PARP escindida, TUNEL y mitocondrias se han descrito anteriormente.

Después de la operación, el paciente será trasladado a la UCI y tratado según la rutina.

El criterio principal de valoración de la observación clínica será la liberación postoperatoria de troponina T cardiaca.

Los investigadores medirán la concentración sérica de troponina T cardíaca (electroquimioluminiscencia "ECLIA", Roche) antes de la operación y las próximas 72 horas desde la extracción de la abrazadera cruzada. Al mismo tiempo, se evaluará el nivel de la isoenzima MB de la creatina quinasa (ensayo enzimático, Roche). El área bajo la curva del nivel del marcador a lo largo del tiempo se comparará entre los grupos.

Para evaluar la función miocárdica, a todos los pacientes se les insertará un catéter en la arteria pulmonar (catéter de Swan Ganz) antes de la operación. Se realizará una evaluación hemodinámica completa (método de termodilución), así como el estado del metabolismo del oxígeno basado en el análisis de gases arteriales y venosos mixtos, antes de la operación y las próximas 48 horas después de la extracción del pinzamiento aórtico.

Además de medir el índice cardíaco, calcularemos los índices de trabajo cardíaco izquierdo y derecho. Se calculará el índice de suministro de oxígeno y la relación de extracción. También se medirán los niveles de lactato. Los investigadores también evaluarán la necesidad de apoyo inotrópico en los mismos momentos utilizando el llamado índice inotrópico.

A todos los pacientes se les realizará un electrocardiograma posoperatorio los días 2 y 4 según la rutina de cuidados posoperatorios y, además, el primer día después de la operación. De manera similar, se realizarán, monitorearán y usarán otras pruebas posoperatorias de rutina que se realizan como parte de la atención posoperatoria de rutina para buscar las diferencias en el curso posoperatorio. Esto incluye ecocardiografía y creatinina (eGFR).