Ischemische preconditionering op afstand van menselijk myocardium

De onderzoekers bestuderen:

1. Weerstand van geïsoleerde rechter atriale pectinaatspiertrabeculae tegen gesimuleerde hypoxie/reperfusie in functioneel orgaanbadmodel
2. Weerstand van geïsoleerde rechter atriale pectinaatspiertrabeculae tegen inductie van apoptose door gesimuleerde hypoxie/reperfusie
3. Weerstand van mitochondriën in geïsoleerde rechter atriale pectinaatspiertrabeculae tegen veranderingen veroorzaakt door gesimuleerde hypoxie/reperfusie

Tegelijkertijd beoordelen we:

1. Hoeveelheid myocardnecrose in vivo geïnduceerd door een periode van ischemie en reperfusie tijdens coronaire bypass-transplantatie (CABG) zoals beoordeeld aan de hand van het vrijgaveprofiel van postoperatieve myocardnecrosemarkers
2. Myocardfunctie in vivo na de periode van ischemie en reperfusie tijdens CABG zoals beoordeeld door hemodynamische metingen (thermodilutiemethode), zuurstoftoevoer/-verbruik en vereisten voor inotrope ondersteuning
3. Inductie van apoptose en status van mitochondria na de periode van ischemie, en reperfusie tijdens CABG zoals vastgesteld in linkerventrikelmyocardbiopten. De onderzoekers zullen proberen de in vitro en in vivo bevindingen van dezelfde patiënten te correleren.

Methodologie De studie zal zowel in vivo als ex-vivo worden uitgevoerd. Patiënten die zijn doorverwezen voor CABG voor stabiele coronaire hartziekte zullen worden gerekruteerd en gerandomiseerd (1:1) door middel van een willekeurige cijfergenerator in een van twee groepen: preconditionering op afstand of "placebo"-interventie. Alleen patiënten bij wie ten minste 3 coronaire bypasstransplantaten met gebruik van cardiopulmonale bypass (CPB) zijn gepland, worden opgenomen. Op de dag van de operatie, na inductie van de anesthesie en vóór de huidincisie, wordt preconditionering op afstand opgewekt. Bij de "placebo"-groep wordt de drukmanchet om de rechterarm geplaatst, maar wordt er niet opgeblazen. Om verblinding te verkrijgen, zullen de opblazingen plaatsvinden onder operatiedoeken en elke keer worden uitgevoerd door dezelfde persoon, die betrokken zal zijn bij het genereren van willekeurige sequenties en het toepassen van preconditionering op afstand, maar niet in de zorg van de patiënt of ander onderzoek gerelateerd taken.

Alle goedgekeurde patiënten zullen preoperatieve echocardiografie, elektrocardiografie en bloedtesten ondergaan, waaronder dwaze bloedtelling, creatinine, BUN en leverfunctietest, uitgevoerd als onderdeel van hun routinematige preoperatieve zorg. Daarnaast zullen troponine T- en CK-MB-niveaus worden beoordeeld. Bovendien zullen patiënten op de 1e dag na de operatie een elektrocardiografie hebben uitgevoerd.

De anesthesie wordt gestandaardiseerd en bestaat uit midazolam 15 mg oraal 1 uur voor de operatie, etomidaat 0,2 mg/kg, fentanyl 5 g/kg en pancuronium 0,1 mg/kg iv voor anesthesie-inductie, propofol 0,5-1,0 mg/kg/u en fentanyl 4g/kg/u infusie voor onderhoud van de anesthesie. Er worden geen verdovende gassen gebruikt. Volledige hemodynamische monitoring zal worden gebruikt met de Swan-Ganz-katheter (niet routinematig bij CABG-patiënten). Preoperatief zullen de eerste hemodynamische metingen en berekeningen van zuurstoftoevoer/-verbruik worden uitgevoerd.

Functionele in vitro beoordeling. Bij canulatie voor CPB wordt bij alle patiënten het rechter atriumaanhangsel geoogst, dat routinematig wordt verwijderd en weggegooid voor plaatsing van een veneuze canule. Het weefsel wordt in ijskoude Krebs-Henseleit-oplossing overgebracht naar het geïsoleerde orgaanlaboratorium van onze afdeling. Er zal één pectinaatspiertrabecula worden geoogst voor basislijnbeoordeling van apoptose of mitochondria (zie hieronder). Een andere enkele trabecula met een diameter van minder dan 1 mm zal in de orgelkamer worden gemonteerd - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Duitsland (HSE)) met Krebs-Henseleit-oplossing. Het wordt geoxygeneerd via glasfrit met carbogen (95% zuurstof, 5% koolstofdioxide) en op 37°C gehouden. De trabecula zal worden aangestuurd met 1 Hz 50 ms vierkante prikkels met behulp van platina veldelektroden en het potentieel van 150% van de drempel voor gegeven preparaat. Er wordt gebruik gemaakt van de stimulator Type 215 (HSE). De contractiekracht wordt gemeten met de F30 isometrische krachtopnemer Type 372 (HSE). Het signaal wordt versterkt met TAM A PlagSYS transducerversterkermodule Type705 (HSE) en opgenomen met PowerLab/4SP-systeem en kaartsoftware (AD Instruments).

De trabecula wordt geleidelijk uitgerekt tot 90% van de optimale spanning volgens de Frank-Starling-relatie en wordt gedurende 30 minuten gestabiliseerd en uitgewassen.

Ischemie van 60 minuten wordt gesimuleerd door zuurstof in carbogen te vervangen door argon (95% argon, 5% koolstofdioxide) en de Krebs-Henseleit-oplossing te vervangen door een oplossing die geen glucose of pyruvaat bevat. Bij reoxygenatie wordt de carbogen weer toegevoegd en wordt de weefselbadoplossing vervangen door een oplossing die aanvankelijk werd gebruikt. Het weefsel wordt meerdere keren gewassen en gedurende 120 minuten reoxygenatieperiode gelaten met elke 15 minuten uitwassen. Dit functionele model van hypoxie-reoxygenatie is eerder in ons laboratorium gebruikt [12-14]. Vervanging van zuurstof door argon resulteert in een daling van de partiële zuurstofdruk in het weefselbad van 475 ± 52 mmHg tot 51 ± 1,8 mmHg (p<0,001) [37-39]. Het gaat gepaard met een aanzienlijke en snelle afname van de isometrische contractiekracht. Tijdens reoxygenatie keert de samentrekkingskracht aanvankelijk terug en vervolgens zien we een langzame afname van spierinotropisme, wat we interpreteren als de ontwikkeling van reoxygenatieletsel. Aan het einde zullen we 10-4 M noradrenaline ((-)-Arterenol Bitartrate) gebruiken om te testen op bedwelming.

De contractiekracht wordt continu geregistreerd. Contractiliteit wordt uitgedrukt in procenten van de initiële contractiekracht voor een bepaalde voorbereiding. De onderzoekers zullen de maximaal herstelde samentrekkingskracht vergelijken, de samentrekkingskracht na 30 minuten en 120 minuten reoxygenatie en de samentrekkingskracht geproduceerd door toevoeging van 10-4M noradrenaline aan het einde van de reoxygenatie.

De onderzoekers zullen ook zoeken naar tekenen van ischemische contractuurontwikkeling, gedefinieerd als een toename van rustspanning van de trabecula. Deze toename, indien aanwezig, begint kort na het begin van hypoxie en gaat gestaag door gedurende de hele hypoxieperiode. De onderzoekers zullen de toename van de spanning in rust (in mN/mg weefselmassa) aan het einde van de hypoxie, dat wil zeggen op het moment van maximale contractuur, vergelijken.

Alle metingen, en in het bijzonder het herstel van de functie, zullen worden vergeleken tussen trabeculae van op afstand gepreconditioneerde en "placebo"-patiënten.

Twee atriale trabeculae van hetzelfde aneurysma, één geoogst bij baseline, en een ander onderworpen aan een functioneel experiment (60 min hypoxie + 120 min reoxygenatie) zullen telkens worden bestudeerd voor:

• apoptose-inductie - Caspase 3 en gesplitste Caspase 3, PARP en gesplitste PARP-expressie gemeten met Western-Blot, of
• apoptose-inductie - beoordeeld met TUNEL en immunohistochemische kleuring voor Caspase 3, gesplitst Caspase 3, PARP en gesplitst PARP, of
• staat van mitochondriën (elektronenmicroscopie) Aangezien we van plan zijn om 120 patiënten te randomiseren (zie hieronder), zal het materiaal voor apoptose- en mitochondria-onderzoeken willekeurig worden genomen van 60 patiënten (30:30) voor Western Blot, 40 patiënten (20:20) voor immunohistochemie en TUNEL, en 20 patiënten (10:10) voor elektronenmicroscopie.

Western Blot (2 trabeculae, basislijn en na hypoxie/reoxygenatie, van 30 op afstand gepreconditioneerde en 30 "placebo"-patiënten).

Voor Western Blot-immunoassay worden de trabeculae in immunohistochemie met vloeibare stikstof geplaatst (2 trabeculae, basislijn en na hypoxie/reoxygenatie, van 20 op afstand gepreconditioneerde en 20 "placebo"-patiënten).

Expressie van Caspase 3, gesplitste Caspase 3, PARP en gesplitste PARP-eiwitten in weefselsecties zal immunohistochemisch worden gedetecteerd. Trabeculae wordt een nacht gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline (fosfaatbuffer), vervolgens door gegradeerde alcoholoplossingen geleid, driemaal verwerkt in xyleen en uiteindelijk ingebed in paraffineblokken. De documentatie van immunohistochemische reacties zal worden uitgevoerd met een SSC-DC58AP-camera (Sony) gekoppeld aan een Nikon Eclipse E400 optische microscoop.

TUNEL (terminaal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick and labeling) (2 trabeculae, basislijn en na hypoxie/reoxygenatie, van 20 op afstand gepreconditioneerde en 20 "placebo"-patiënten).

Weefselcoupes worden gedeparaffineerd in 2 wisselingen van xyleen gedurende elk 5 minuten, en gehydrateerd met 2 wisselingen van 100% ethanol gedurende 3 minuten en 95% ethanol gedurende 1 minuut. De documentatie van immunohistochemische reacties zal worden uitgevoerd met een SSC-DC58AP-camera (Sony) gekoppeld aan een Nikon Eclipse E400 optische microscoop.

Elektronenmicroscopie (2 trabeculae, basislijn en na hypoxie/reoxygenatie, van 10 op afstand gepreconditioneerde en 10 "placebo"-patiënten).

Trabeculae worden in cacodylbuffer met 2% glutaaraldehyde geplaatst. De mitochondriën zullen worden gemicrofotografeerd met een JEOL-JEM 100CX transmissie-elektronenmicroscoop (JEOL Inc, Peabody, Mass) met een vergroting x16000. De elektronenmicrofoto's worden vervolgens opgeslagen en de grootte en structuur van de mitochondriën worden geanalyseerd met behulp van Image ProPlus-software (Media Scanalytics).

De in vivo proef De operatie wordt uitgevoerd met behulp van CPB bij normothermie door een ervaren hartchirurg. Intermitterende warmbloed (37°C) antegrade cardioplegie (miniplegie) zal worden gebruikt voor myocardiale bescherming. Aangezien alleen patiënten die ten minste 3 coronaire bypass-transplantaten nodig hebben, worden gerekruteerd, verwachten we dat de kruisklemtijd van de aorta ten minste 30 minuten zal duren. Na verwijdering van de kruisklem worden de proximale anastomosen uitgevoerd met behulp van een zijbijtklem. De patiënt wordt gespeend van CPB, hemostase wordt beveiligd en de borstkas wordt gesloten over thoraxslangen. Vlak voor het sluiten van de borst wordt een 16G-naald-true-cut biopsie van het linkerventrikelmyocardium verkregen uit het apexgebied. De onderzoekers verwachten dat de reperfusietijd vanaf het verwijderen van de kruisklem tot het verkrijgen van de biopsie ten minste 40 minuten zal duren. De exacte ischemie (cross-clamp) tijd en reperfusietijd (tot het verkrijgen van de biopsie) zullen worden gemeten.

De myocardiale biopsieën worden op dezelfde manier geoogst en beoordeeld als atriale trabecule. De onderzoekers zullen willekeurig Western-blotting uitvoeren in 60 (30:30) biopsieën geoogst op vloeibare stikstof, immunohistochemie inclusief TUNEL in 40 (20:20) geoogst op 10% neutraal gebufferde formaline, en elektronenmicroscopie in 20 (10:10) geoogst op cacodylbuffer met 2% glutaaraldehyde. De methoden voor het beoordelen van Caspase3, gesplitste Caspase 3, PARP, gesplitste PARP, TUNEL en mitochondriën zijn hierboven beschreven.

Na de operatie wordt de patiënt overgebracht naar de IC en behandeld zoals gebruikelijk.

Het primaire eindpunt van klinische observatie zal de postoperatieve afgifte van cardiaal troponine T zijn.

De onderzoekers zullen de serumconcentratie van cardiaal troponine T (elektrochemiluminescentie "ECLIA", Roche) preoperatief en de volgende 72 uur na verwijdering van de kruisklem meten. Tegelijkertijd wordt het niveau van creatinekinase iso-enzym MB bepaald (enzymatische assay, Roche). Het gebied onder de curve van het markeringsniveau in de loop van de tijd zal tussen de groepen worden vergeleken.

Om de myocardfunctie te beoordelen, wordt bij alle patiënten preoperatief een longslagaderkatheter (Swan Ganz-katheter) ingebracht. De volledige hemodynamische beoordeling (thermodilutiemethode) en de status van het zuurstofmetabolisme op basis van arteriële en gemengd-veneuze gasanalyse zullen preoperatief worden uitgevoerd en de volgende 48 uur na verwijdering van de kruisklem van de aorta.

Naast het meten van de cardiale index, zullen we ook de linker en rechter cardiale werkindices berekenen. De zuurstofafgifte-index en extractieverhouding worden berekend. Ook wordt het lactaatgehalte gemeten. De onderzoekers zullen ook de behoefte aan inotrope ondersteuning op dezelfde tijdstippen beoordelen met behulp van de zogenaamde inotrope index.

Alle patiënten krijgen postoperatief een elektrocardiogram op dag 2 en 4 volgens de postoperatieve zorgroutine en bovendien op de 1e dag na de operatie. Evenzo zullen andere routinematige postoperatieve tests die worden uitgevoerd als onderdeel van de routinematige postoperatieve zorg worden uitgevoerd, gecontroleerd en gebruikt om te zoeken naar de verschillen in postoperatief beloop. Dit omvat zowel echocardiografie als creatinine (eGFR).