Fjern iskemisk prekondisjonering av humant myokardium

Etterforskerne vil studere:

1. Motstand av isolerte høyre atrial pektinatmuskeltrabeculae mot simulert hypoksi/reperfusjon i funksjonell organbadmodell
2. Motstand av isolerte høyre atrial pektinatmuskeltrabeculae mot induksjon av apoptose ved simulert hypoksi/reperfusjon
3. Motstand av mitokondrier i isolerte høyre atrial pektinatmuskeltrabeculae mot endringer indusert av simulert hypoksi/reperfusjon

Samtidig vil vi vurdere:

1. Mengde myokardnekrose in vivo indusert av periode med iskemi og reperfusjon under koronararterie-bypass-transplantasjon (CABG) som vurdert av postoperativ myokardnekrose-markørfrigjøringsprofil
2. Myokardfunksjon in vivo etter perioden med iskemi og reperfusjon under CABG, vurdert ved hemodynamiske målinger (termodilusjonsmetode), oksygentilførsel/-forbruk og inotropisk støttebehov
3. Induksjon av apoptose og status for mitokondrier etter perioden med iskemi, og reperfusjon under CABG som vurdert i venstre ventrikkel myokardbiopsier. Utforskerne vil prøve å korrelere in vitro og in vivo funnene fra de samme pasientene.

Metodikk Studien vil bli gjennomført både in vivo og ex-vivo. Pasienter henvist til CABG for stabil koronararteriesykdom vil bli rekruttert og randomisert (1:1) ved hjelp av tilfeldig siffergenerator til en av to grupper: fjernprekondisjonering eller "placebo"-intervensjon. Kun pasienter hvor det er planlagt minst 3 koronar bypass-graft med bruk av kardiopulmonal bypass (CPB) vil bli inkludert. På operasjonsdagen, etter induksjon av anestesi og før hudsnittet vil fjernprekondisjonering bli utløst. "Placebo"-gruppen vil ha trykkmansjetten plassert på høyre arm, men ingen oppblåsninger vil bli utført. For å oppnå blending vil oppblåsningen skje under kirurgiske gardiner, og vil bli utført av samme person hver gang, som vil være involvert i generering av tilfeldig sekvens og fjernbehandling, men ikke i omsorgen for pasienten, eller annen forskningsrelatert oppgaver.

Alle pasienter som har samtykket vil få utført preoperativ ekkokardiografi, elektrokardiografi og blodprøver inkludert tullblodtelling, kreatinin, BUN og leverfunksjonstest som en del av deres rutinemessige preoperative behandling. I tillegg vil troponin T- og CK-MB-nivåer bli vurdert. I tillegg vil pasienter ha utført elektrokardiografi 1. dag etter operasjon.

Anestesi vil være standardisert og bestå av midazolam 15mg oralt 1 time før operasjon, etomidat 0,2mg/kg, fentanyl 5g/kg og pankuronium 0,1mg/kg iv for anestesiinduksjon, propofol 0,5-1,0 mg/kg/t og fentanyl 4g/kg/t infusjon for vedlikehold av anestesi. Ingen bedøvelsesgasser vil bli brukt. Full hemodynamisk overvåking vil bli brukt med Swan-Ganz-kateter (ikke rutine hos CABG-pasienter). Første hemodynamiske målinger og oksygentilførsel/forbruksberegninger vil bli utført preoperativt.

Funksjonell in vitro vurdering. Ved kanylering for CPB vil høyre atrievedheng, som rutinemessig fjernes og kastes for venøs kanyleplassering, høstes hos alle pasienter. Vevet ble overført i iskald Krebs-Henseleit-løsning til det isolerte organlaboratoriet på vår avdeling. En pektinatmuskeltrabecula vil bli høstet for baselinevurdering av apoptose eller mitokondrier (se nedenfor). En annen enkelt trabekel mindre enn 1 mm i diameter vil bli montert i orgelkammeret - Schuler Organbath (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Tyskland (HSE)) som inneholder Krebs-Henseleit-løsning. Den vil oksygeneres via glassfritte med karbogen (95 % oksygen, 5 % karbondioksid) og holdes ved 37°C. Trabecula vil bli drevet med 1Hz 50ms kvadratstimuli ved bruk av platinafeltelektroder og potensialet på 150 % av terskelen for gitt forberedelse. Stimulatoren Type 215 (HMS) vil bli brukt. Sammentrekningskraften vil bli målt med F30 isometrisk krafttransduser Type 372 (HSE). Signalet vil bli forbedret med TAM A PlagSYS transduserforsterkermodul Type705 (HSE) og tatt opp med PowerLab/4SP-system og kartprogramvare (AD Instruments).

Trabecula vil gradvis strekkes til 90 % av optimal spenning i henhold til Frank-Starling-forholdet og la stå i 30 minutter med stabilisering og utvasking.

60 min iskemi vil bli simulert ved å erstatte oksygen i karbogen med argon (95 % argon, 5 % karbondioksid) og erstatte Krebs-Henseleit-løsning med en som ikke inneholder glukose eller pyruvat. Ved reoksygenering vil karbogen tilsettes igjen og vevsbadløsningen vil bli erstattet med en som ble brukt først. Vevet ble vasket flere ganger og stått i 120 minutter med reoksygeneringsperiode med utvasking hvert 15. minutt. Denne funksjonelle modellen for reoksygenering av hypoksi har blitt brukt i vårt laboratorium før [12-14]. Utskifting av oksygen med argon resulterer i et fall av oksygenpartialtrykket i vevsbadet fra 475±52 mmHg til 51±1,8 mmHg (p<0,001) [37-39]. Det er ledsaget av betydelig og rask nedgang i isometrisk sammentrekningskraft. Under reoksygenering kommer sammentrekningskraften tilbake til å begynne med, og deretter observerer vi langsom nedgang i muskelinotropisme, som vi tolker som utvikling av reoksygeneringsskade. På slutten vil vi bruke 10-4 M noradrenalin ((-)-Arterenol Bitartrate) for å teste for bedøvelse.

Sammentrekningskraften vil bli registrert fortløpende. Kontraktilitet vil uttrykkes i prosent av den opprinnelige sammentrekningskraften for gitt forberedelse. Undersøkerne vil sammenligne maksimal gjenvunnet kontraksjonskraft, kontraksjonskraften etter 30 minutter og 120 minutter med reoksygenering og kontraksjonskraften produsert ved å tilsette 10-4M noradrenalin ved slutten av reoksygenering.

Etterforskerne vil også se etter tegn på utvikling av iskemisk kontraktur definert som en økning i hvilespenning i trabecula. Denne økningen, hvis den er tilstede, starter kort tid etter begynnelsen av hypoksi og fortsetter jevnt gjennom hele hypoksiperioden. Etterforskerne vil sammenligne økningen i hvilespenning (i mN/mg vevsmasse) ved slutten av hypoksi, det vil si på tidspunktet for maksimal kontraktur.

Alle målinger, og spesielt gjenoppretting av funksjon, vil bli sammenlignet mellom trabekler fra fjernt prekondisjonerte og "placebo" pasienter.

To atrielle trabekler fra samme vedheng, en høstet ved baseline, og en annen utsatt for funksjonelt eksperiment (60 min hypoksi + 120 min reoksygenering) vil bli studert hver gang for:

• apoptose induksjon - Caspase 3 og spaltet Caspase 3, PARP og spaltet PARP ekspresjon målt med Western-Blot, eller
• apoptose induksjon - vurdert med TUNEL og immunhistokjemifarging for Caspase 3, spaltet Caspase 3, PARP og spaltet PARP, eller
• tilstand av mitokondrier (elektronmikroskopi) Ettersom vi planlegger å randomisere 120 pasienter (se nedenfor) vil materialet for apoptose- og mitokondriestudier bli tilfeldig tatt fra 60 pasienter (30:30) for Western Blot, 40 pasienter (20:20) for immunhistokjemi og TUNEL, og 20 pasienter (10:10) for elektronmikroskopi.

Western Blot (2 trabeculae, baseline og etter hypoksi/reoksygenering, fra 30 eksternt prekondisjonerte og 30 "placebo" pasienter).

For Western Blot immunoassay vil trabeculae bli plassert i flytende nitrogen Immunohistokjemi (2 trabeculae, baseline og etter hypoksi/reoksygenering, fra 20 eksternt prekondisjonerte og 20 "placebo" pasienter).

Ekspresjon av Caspase 3, spaltet Caspase 3, PARP og spaltede PARP-proteiner i vevssnitt vil bli påvist immunhistokjemisk. Trabeculae vil bli fiksert over natten i 10 % nøytralbufret formalin (fosfatbuffer), deretter ført gjennom graderte alkoholløsninger, behandlet tre ganger i xylen og til slutt innebygd i parafinblokker. Dokumentasjonen av immunhistokjemiske reaksjoner vil bli utført med SSC-DC58AP kamera (Sony) kombinert med Nikon Eclipse E400 optisk mikroskop.

TUNEL (terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick og merking) (2 trabeculae, baseline og etter hypoksi/reoksygenering, fra 20 eksternt prekondisjonerte og 20 "placebo" pasienter).

Vevsseksjoner vil bli avparafinisert i 2 skift av xylen i 5 minutter hver, og hydrert med 2 skift av 100 % etanol i 3 minutter hver, og 95 % etanol i 1 minutt. Dokumentasjonen av immunhistokjemiske reaksjoner vil bli utført med SSC-DC58AP kamera (Sony) kombinert med Nikon Eclipse E400 optisk mikroskop.

Elektronmikroskopi (2 trabeculae, baseline og etter hypoksi/reoksygenering, fra 10 eksternt prekondisjonerte og 10 "placebo" pasienter).

Trabeculae vil bli plassert i cacodylbuffer med 2% glutaraldehyd. Mitokondriene vil bli mikrografert med JEOL-JEM 100CX transmisjonselektronmikroskop (JEOL Inc, Peabody, Mass) med forstørrelse x16000. Elektronmikrofotografiene vil deretter bli lagret og mitokondrienes størrelse og struktur vil bli analysert ved hjelp av Image ProPlus-programvare (Media Scanalytics).

In vivo-forsøket Operasjonen vil bli utført med bruk av CPB ved normotermi av erfaren hjertekirurg. Intermitterende varmblods (37°C) antegrad kardioplegi (miniplegi) vil bli brukt for myokardbeskyttelse. Siden kun pasienter som krever minst 3 koronare bypass-transplantater vil bli rekruttert, forventer vi at aortakryssklemmetiden varer minst 30 minutter. Etter fjerning av kryssklemme vil de proksimale anastomosene utføres ved hjelp av sidebiteklemme. Pasienten vil bli avvent fra CPB, hemostase vil bli sikret og brystkassen lukkes over brystrør. Rett før lukking av brystet vil 16G nåle-true cut biopsi av venstre ventrikkel myokard bli tatt fra apex-området. Etterforskerne forventer at reperfusjonstiden fra fjerning av tverrklemmen til oppnåelse av biopsien varer minst 40 minutter. Den nøyaktige tiden for iskemi (kryssklemme) og reperfusjonstid (inntil biopsien er oppnådd) vil bli målt.

Myokardbiopsiene vil bli høstet og vurdert på samme måte som atrial trabecule. Etterforskerne vil tilfeldig utføre Western blotting i 60 (30:30) biopsier høstet på flytende nitrogen, immunhistokjemi inkludert TUNEL i 40 (20:20) høstet på 10 % nøytral bufret formalin, og elektronmikroskopi i 20 (10:10) høstet på cacodylbuffer med 2% glutaraldehyd. Metodene for å vurdere Caspase3, spaltet Caspase 3, PARP, spaltet PARP, TUNEL og mitokondrier er beskrevet ovenfor.

Etter operasjonen vil pasienten bli overført til intensivavdelingen og behandlet som rutinemessig.

Det primære endepunktet for klinisk observasjon vil være postoperativ frigjøring av hjertetroponin T.

Etterforskerne vil måle serumkonsentrasjonen av hjerte-troponin T (elektrokjemiluminescens "ECLIA", Roche) preoperativt og neste 72 timer etter fjerning av kryssklemmer. Samtidig vil nivået av kreatinkinase isoenzym MB bli vurdert (enzymatisk analyse, Roche). Arealet under kurven til markørnivået over tid vil sammenlignes mellom gruppene.

For å vurdere myokardfunksjonen vil alle pasienter få satt inn lungearteriekateter (Swan Ganz-kateter) preoperativt. Full hemodynamisk vurdering (termodilusjonsmetode) samt oksygenmetabolismestatus basert på arteriell og blandet venøs gassanalyse vil bli utført preoperativt og neste 48 timer etter fjerning av aorta kryssklemme.

I tillegg til å måle hjerteindeksen vil vi beregne venstre og høyre hjertearbeidsindekser. Oksygentilførselsindeksen og ekstraksjonsforholdet vil bli beregnet. Laktatnivåene vil også bli målt. Utforskerne vil også vurdere behovet for inotrop støtte på samme tidspunkt ved bruk av såkalt inotropisk indeks.

Alle pasienter vil ha postoperativt elektrokardiogram på dag 2 og 4 i henhold til postoperativ behandlingsrutine og i tillegg på 1. dag etter operasjon. Tilsvarende vil andre rutinemessige postoperative tester som utføres som en del av den rutinemessige postoperative omsorgen utføres, overvåkes og brukes til å se etter forskjellene i postoperativt forløp. Dette inkluderer ekkokardiografi så vel som kreatinin (eGFR).