CIQTP 연장 : 급성 심장사의 역할과 기전 (IQARE-SCD)

심장 돌연사(SCD)는 선진국에서 주요 사망 원인입니다. 프랑스에서는 매년 약 40,000~50,000명이 갑자기 사망합니다. 이러한 사망의 대부분은 노인과 관련이 있으며 관상 동맥 질환과 관련이 있습니다. 그러나 프랑스에서는 매년 1~45세 사이의 약 4000~5000명이 갑자기 사망합니다. SCD는 종종 식별 가능한 ECG 이상과 구조적 결함이 없는 어린 환자에게서 발생합니다. 결과적으로 젊은 성인의 대부분의 SCD 사건은 설명되지 않은 상태로 남아 있으며 특발성 심실 세동(IVF)으로 알려진 애매한 그룹으로 분류됩니다.

조사관은 최근에 SCD를 담당하는 새로운 부정맥 개체(카테콜아민 유발 QT 연장; CIQTP)를 확인했으며 휴식 시 정상적인 QT 지속 시간을 특징으로 하지만 정신적 스트레스 테스트 동안 주요 QT 연장을 특징으로 합니다. 이 중개 프로젝트의 목적은 설명할 수 없는 SCD에서 희귀 질환의 이 새로운 표현형의 유병률을 결정하고 근본적인 병태생리학적 메커니즘을 확인하는 것입니다.

정신 스트레스 검사의 사용은 긴 QT 증후군과 같은 다른 유전성 부정맥 질환으로 확장될 수 있습니다. 영향을 받은 새로운 친척을 식별할 수 있는 가능성을 고려할 때 가족의 심장 돌연사 재발 위험을 크게 줄일 수 있습니다.

이 프로젝트의 주요 쟁점은 SCD로 이어지는 이 새로운 증후군의 임상적 의미와 병태생리학적 메커니즘을 설명하는 것입니다.

이 카테콜라민 유도 QT 연장에 대한 최근 설명을 바탕으로 연구자들은 다음과 같은 가설을 세웁니다.

• 이 증후군은 완전한 가족 스크리닝7 후 진단되지 않은 가족 IVF의 60%에 부분적으로 관여합니다. 실제로, 베이스라인 ECG는 MST 없이 정상이므로, 이전에 유전성 부정맥 질환의 영향을 받지 않는 것으로 간주되었던 발의자 및 친척의 정신적 스트레스 테스트에 의해 이러한 임상 특징의 식별이 수행될 수 있습니다.
• 정신 스트레스 테스트는 긴 QT 증후군과 같은 다른 유전성 부정맥의 경계선 사례를 식별하는 데 도움이 됩니다. 실제로, 이 유전성 부정맥은 베이스라인 ECG에서 관찰되는 QT 간격의 유전적 기반 연장을 특징으로 하지만, 환자의 1/3 이상이 베이스라인에서 약간의 QT 연장만 보입니다. 결과적으로 도발 테스트(예: 운동 테스트 및 아드레날린 테스트) 병리적 QT 연장을 밝히기 위해18. 연구자는 MST가 이러한 QT 연장을 밝히는 데 도움이 될 수 있다고 가정합니다.
• 이 질병에 대해 최근에 기술된 상염색체 유전 방식 연구자에 기초하여 연구자는 이 증후군이 멘델 장애에 속한다고 가정합니다. 따라서 연구자들은 CIQTP 증후군과 관련된 주요 유전자를 식별하기 위해 가족 기반 접근법을 적용할 것을 제안합니다.

이 프로젝트의 범위는 심장 돌연사로 이어지는 이 새로운 증후군의 임상적 의미와 병태생리학적 메커니즘을 설명하는 것입니다. 보다 구체적으로 조사관은 다음을 목표로 합니다.

• 설명되지 않는 SCD에서 CIQTP의 유병률을 확인하고 영향을 받는 새로운 대규모 가족을 식별합니다.
• QT 연장에서 정신적 스트레스의 역할 확인
• 대가족에서 전체 게놈 시퀀싱과 Identity By Descent 분석을 결합하여 질병과 관련된 유전자를 식별합니다.
• CIQTP 환자의 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(iPSC-CM)의 전사체 및 전기생리학적 프로파일링을 수행하여 추정 바이오마커 및 병태생리학적 메커니즘을 식별합니다.

이 병진 접근 방식을 기반으로 연구자들은 돌연심장사에서 CIQTP의 병태생리학 및 임상적 의미를 설명하는 것을 목표로 합니다. 전체 게놈 시퀀싱 및 iPSC-CM 프로파일링과 같은 혁신적인 접근 방식을 사용하는 이 새로운 증후군에 대한 설명은 설명되지 않는 SCD 분야에서 포괄적이고 주요한 진전을 제공할 수 있습니다. 새로 영향을 받은 친척의 식별 및 관리를 넘어 유전/병리생리 기반 치료법을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다.

연구자들은 이미 MST가 이 새로운 증후군을 감지하는 매우 효율적인 진단 도구임을 입증했으며 연구자들은 MST가 침묵 LQTS 돌연변이 보인자에서 QT 연장을 밝히는 데에도 도움이 될 수 있다고 믿습니다. MST는 빠르고 간단하게 적용할 수 있다는 장점이 있습니다. 따라서 상 염색체 우성 유전을 나타내는 설명되지 않은 심장 전기 결함에 대한 가족 분리를 밝히는 것이 큰 관심이 될 수 있습니다. LQTS에서 발생하는 명백한 비침투를 추가로 줄일 수 있습니다.

프로젝트의 작업

작업 1: 설명할 수 없는 SCD에서 CIQTP 유병률 확인 및 영향을 받는 새로운 가족 식별

45세 이전의 대부분의 SCD 사례는 설명되지 않은 상태로 남아 있으며 유전성 부정맥 질환으로 인한 것일 수 있습니다6. 설명되지 않는 SCD 후 Nantes, Rennes, Tours 또는 Brest University Hospitals로 회부된 모든 연속 가족이 연구에 포함됩니다.

사용 가능한 모든 임상 프로밴드 데이터는 추천 의사 및 친척으로부터 수집됩니다. 부검 시 진단이 가능한 프로밴드는 연구에서 제외된다.

가족 선별 45세 이전 원인 불명의 SCD 이후 가족 선별은 직계 가족을 대상으로 실시한 후 양성인 경우 다른 친척으로 확대합니다. 1차 친족이 선별검사가 불가능한 경우에는 더 먼 친족에게 시행하게 됩니다.

임상 선별에는 과거 병력, 임상 검사 및 기준선 ECG 검토가 포함됩니다. 이 첫 번째 일련의 검사 후 진단이 없는 경우 스트레스 테스트, 경흉부 심초음파(TTE), 아즈말린(1mg/kg) 또는 플레카이니드(2mg/kg) 및 에피네프린 검사를 통한 나트륨 채널 차단제 챌린지(SCBC)23, 24 공연됩니다. 정상적인 기준선 ECG 25로 QT 연장을 밝히기 위해 정신적 스트레스 테스트를 추가로 수행합니다.

정신 스트레스 테스트 프로토콜(부록 2) MST는 다음과 같이 수행됩니다. 환자는 검사 과정에 대한 설명 없이 앙와위 자세로 배치됩니다. ECG는 기준선에서 기록되며 테스트 중에 영구적으로 기록됩니다. MST는 환자의 교육 수준(암산, 지리 또는 어린 이용 디즈니 캐릭터 이름)에 따라 정확하고 신속한 답변을 요구하는 조건으로 갑자기 수행됩니다. MST는 심박수가 분당 최소 20회 이상 증가하는 경우 관련이 있는 것으로 간주됩니다. 심박수가 분당 20회 증가하지 않는 경우, QTc의 현저한 연장이 확인되지 않는 한 테스트는 해석할 수 없는 것으로 간주됩니다. MST는 일반적으로 2분 미만으로 지속됩니다. 심박수가 가장 낮은 ECG 추적을 얻기 위해 테스트 종료 후 30분 후에 새로운 ECG가 기록됩니다.

진단

스트레스 테스트 동안 및 약리학적 테스트 동안 베이스라인에서 수행된 ECG는 임상 및 유전적 상태에 대해 맹검인 2명의 의사에 의해 검토될 것이다. 모든 데이터는 핵심 데이터베이스에 수집됩니다.

진단 기준은 최신 컨센서스 회의24,26의 지침을 준수했습니다. 조사관은 추가로 에피네프린 또는 정신적 스트레스 테스트 동안 델타 QTm > 30ms와 스트레스 테스트 후 3분에 델타 QTc > 30ms를 LQTS 진단에 충분한 것으로 고려할 것입니다27,28.

카테콜라민 제거를 가능하게 하기 위해 각 검사 사이에 최소 30분의 간격을 두어야 합니다. 모든 테스트는 테스트를 방해할 수 있는 각 치료를 중단한 후 최소 5일 후에 수행됩니다.

이 연구는 임상 및 유전 연구에 대한 유럽 지침에 따라 수행됩니다. 프로토콜 승인은 기관 윤리 위원회에서 얻을 것입니다. 임상 및 유전 연구에 참여하기로 동의한 각 환자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻을 것입니다.

통계 분석 통계 분석은 Social Science® 소프트웨어(IBM Corp., Armonk, New York)로 수행됩니다. 범주형 변수는 숫자와 백분율로 표시됩니다. 카이 제곱 또는 피셔 정확 검정(예상 빈도 기반)을 사용하여 그룹 간 범주형 변수를 비교합니다.

양적 변수는 평균 ± 표준 편차 또는 중앙값(25번째; 75번째)으로 표시됩니다. 연속 변수의 분석은 분포에 기반한 t-테스트 또는 Mann Whitney 테스트를 사용하여 수행됩니다. 가족 간 비교는 가족 규모에 대한 편견을 제한하기 위해 가족 내 평균값 또는 연속 변수의 중앙값을 사용하여 수행됩니다. 0.05 미만의 양면 P-값은 모든 테스트에서 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주됩니다.

작업 2: QT 연장에서 정신적 스트레스의 역할 확인

QT 연장에서 정신적 스트레스의 역할을 확인하기 위해 연구자들은 추가로 Nantes, Rennes, Tours 또는 Brest University Hospitals의 양성 및 음성 대조군을 등록할 것입니다.

이것은 기준선에서 QT 연장 없이 긴 QT 증후군에 의해 영향을 받는 가족의 연속적인 친척 등록으로 구성됩니다. 이 검사의 결과는 운동 검사와 에피네프린 검사를 사용하는 기존의 선별 검사와 비교됩니다. 따라서 연구자들은 긴 QT 증후군(LQT1, LQT2 및 LQT3, 양성 대조군)의 주요 유전 기반 형태의 보균자로 추가로 정의된 환자를 등록하는 것을 목표로 합니다.

연구자들은 정상 베이스라인 ECG, 심장 구조적 이상이 없고 MST를 방해할 수 있는 약물이 없는 건강한 환자의 음성 대조군을 추가로 등록할 것입니다. 이 모집단은 설명되지 않는 SCD 선별 검사에 대해 음성인 가족의 친척으로 구성됩니다.

진단 기준 및 테스트 프로토콜은 작업 1에서 정의한 것과 동일합니다.

각 측정에 대해 3개의 연속 비트가 사용되며 두 명의 조사자가 얻은 평균값이 고려됩니다. QT 간격은 QRS 복합체의 시작부터 T파의 끝까지(T파의 접선과 등전선의 교차점으로 정의됨) DII 또는 V5로 측정됩니다. U파는 QT 간격 측정에서 제외됩니다.

이 연구는 임상 및 유전 연구에 대한 유럽 지침에 따라 수행됩니다. 프로토콜 승인은 기관 윤리 위원회에서 얻을 것입니다. 임상 및 유전 연구에 참여하기로 동의한 각 환자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻을 것입니다.

통계 분석은 Social Science® 소프트웨어(IBM Corp., Armonk, New York)로 수행됩니다. 그룹 간의 비교는 기준선에서 그리고 두 테스트(정신 스트레스 테스트, 운동 테스트, 에피네프린 테스트) 동안 각 임상 및 ECG 매개변수에 대해 수행됩니다. 범주형 변수는 숫자와 백분율로 표시됩니다. 카이 제곱 또는 피셔 정확 검정(예상 빈도 기반)을 사용하여 그룹 간 범주형 변수를 비교합니다. 양적 변수는 평균 ± 표준 편차 또는 중앙값(25번째; 75번째)으로 표시됩니다. 연속 변수의 분석은 분포에 기반한 t-테스트 또는 Mann Whitney 테스트를 사용하여 수행됩니다. 0.05 미만의 양면 P-값은 모든 테스트에서 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주됩니다.

조사자는 이미 30명의 건강한 대조군과 LQTS(LQT1=9 또는 LQT2=16)에 영향을 받지만 휴식 QTc<480ms인 25명의 대상으로 구성된 모집단을 Nantes 병원에 등록했습니다. 첫 번째 결과는 운동 검사, 에피네프린 검사 및 MST의 민감도가 가족 내에서 각각 60%, 95% 및 94%, 양성 대조군 내에서 76%, 93% 및 92%임을 확인했습니다. 모든 테스트. 이것은 MST 검사가 명확한 QT 연장이 없는 긴 QT 환자에게 관심이 있을 수 있음을 확인시켜줍니다.

작업 3: 질병과 관련된 특정 유전자 식별

목표: 혈통 내에서 VF의 위험에 크게 기여하는 새로운 유전자의 희귀 변종을 식별합니다.

6개의 SCD(2개 소생 포함)를 나타내는 4개의 대규모 IVF 가족과 어린 나이에 발생하는 7개의 설명되지 않는 실신 에피소드가 Nantes에서 특징지어졌습니다. 그 중 각각 9, 10, 11 및 4 가족 구성원은 모든 LQTS 관련 유전자가 음성인 반면 MST 및/또는 다른 도발 테스트 후 연장된 QT 간격을 나타냅니다. 이 새로운 임상 실체에 대한 설명은 최근 Journal of the American College of Cardiology17에 출판 승인되었습니다. 가족 내에서 유 전적으로 먼 개인의 VF / SCD 또는 ECG 이상이 발생하면 유전 적 거리가 클수록 환자가 공유하는 변이가 적기 때문에 가계는 유전 연구에 매우 강력합니다. 주목할 만한 추가 친척은 임상적으로 조사될 것이며(아래 가계도에 물음표 기호가 있는 개인) 유전학 연구의 힘을 증가시킬 수 있습니다. J. Barc와 Nantes 그룹의 이전 작업은 이러한 야심 찬 프로젝트, 특히 차세대 시퀀싱과 결합된 가족 접근 방식을 기반으로 하는 유전자 발견을 주도할 수 있는 우리의 능력을 보여주었습니다.

작업3.1: 영향을 받는 가족 구성원의 전체 게놈 유전자형 및 분석 목표: 영향을 받는 구성원이 공유하는 게놈 영역을 식별합니다.

영향을 받는 모든 가족 구성원에 대한 게놈 차원의 유전형 분석은 Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array(PMRA) Plate on Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel(저희 연구실 Nantes의 게놈 핵심 시설을 통해 이용 가능한 기기)을 사용하여 수행됩니다. 영향을 받는 가족 구성원이 공유하는 게놈 영역은 이전에 설명한 대로 IBD(Identity By Descent) 분석으로 평가됩니다. 이 단계는 원인 변이가 있는 게놈 영역을 정제하는 데 중요합니다. 가족의 큰 규모에 따라 연구자들은 상대적으로 작은 게놈 영역이 이 분석에서 나올 것이라고 예상할 수 있습니다. 잠재적 공통 유전자를 나타내는 가족 간의 잠재적 공유 영역에 주의를 기울일 것입니다.

작업3.2: 전체 게놈 시퀀싱 및 분석 목표: 영향을 받는 가족 구성원이 공유하는 게놈 영역 중에서 희귀 변종을 식별합니다.

여기에서 조사관은 4개의 가계 각각에서 CIQTP 증후군에 의해 영향을 받는 3명의 먼 친척 개인에서 게놈 시퀀싱을 수행해야 합니다. 게놈 시퀀싱의 이점은 포획 및 PCR 단계가 없기 때문에 포획 인공물, 덮이지 않은 영역을 강력하게 제한하고 비암호화 영역에 속하는 필수 조절 요소 내에서 돌연변이를 발견할 가능성을 제공합니다. 시퀀싱은 National Genotyping Center(CEA-CNG)와 공동으로 수행됩니다. NGS 파이프라인은 Broad Institute GATK "모범 사례" broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php의 권장 사항을 따릅니다. 기본적으로 읽기는 bwa-mem을 사용하여 매핑되고 중복은 picard를 사용하여 제거되며 GATK는 읽기를 재정렬하고 재조정하는 데 사용됩니다. 변형은 HaplotypeCaller로 호출되고 GATK로 재보정됩니다. 생성된 VCF는 Ensembl Variant Effect 예측자로 주석 처리됩니다. VCF 파일과 각 혈통 내에서 조사관은 영향을 받는 3명의 개인이 공유하고 공유 게놈 영역(IBD)에 포함된 변이체의 우선 순위를 지정해야 합니다. 공유 변이에서 조사자는 희귀 변이에 초점을 맞춘 다음 일반 인구에서 일반적인 변이를 필터링해야 합니다(소수 대립유전자 빈도 >0.1%). 이를 위해 조사관은 The gnomAD 컨소시엄, 1000Genomes, 네덜란드의 Genome 및 구체적으로 Nantes 지역의 인구통계 일치 컨트롤(PREGO 연구 -www.vacarme-project.org). 이것은 가족당 소수의 "후보" 변종/유전자의 짧은 목록을 생성할 것으로 예상됩니다. 이들의 기능적 효과에 대한 생물 정보학 예측은 SIFT 및 Polyphen2 프로그램에 의해 평가되어 이들 중 추정되는 악성 변종을 강조합니다. 조사관은 Sanger 시퀀싱에 의해 이러한 방식으로 식별된 모든 변종을 검증하고 각 가계에서 영향을 받는 다른 가족 구성원과의 공동 분리를 조사합니다. 프랑스의 유전체학(IBiSA) 및 생물정보학(Institut Français de Bioinformatique) 인프라로 인정받고 있는 우리 연구실 낭트의 유전체학 및 생물정보학 핵심 시설에 대한 경험과 NGS 데이터 관리 경험이 결합되어 이 작업의 타당성을 보장할 것입니다. 또한 우리 그룹에서는 1000개 이상의 전체 게놈(심장병 환자 및 일반 인구 포함)을 수집하는 대규모 게놈 시퀀싱 프로젝트가 진행 중입니다. 이 프로젝트의 경험은 작업 #3 분석의 효율성과 성공 가능성을 강화할 것입니다.

작업 4: CIQTP 환자의 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포의 전사체 및 전기생리학적 프로파일링을 수행하여 추정되는 바이오마커 및 병태생리학적 메커니즘을 식별합니다.

연구자들은 CIQPT 환자로부터 생성된 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(iPSC-CM)가 질병과 관련된 전반적인 유전자 발현 변화 및 전기생리학적 변화를 식별할 수 있게 해줄 것이라는 가설을 세웠습니다. 이를 위해 조사관은 작업 3에 설명된 4개 가족 구성원으로부터 생성된 iPSC-CM을 비교하는 것을 목표로 합니다. 각 가계 내에서 조사관은 한 명의 "제어" 건강한 대상(가족 QT 연장을 제시하지 않음)과 2명의 CIPQT 환자를 선택합니다.

양성 LQT 제어 및 음성 건강한 제어 iPS 세포주는 이 작업의 타당성을 입증하는 LQT2에 대한 이전 연구의 맥락에서 낭트에서 이미 생성 및 연구되었습니다. 이는 또한 CIPQT transcriptomic 및 electrophysiological 서명을 LTQ2 서명과 비교할 수 있는 기회를 제공합니다. 각 라인에 대해 3개의 iPS 세포 클론이 검증되었습니다. 모든 라인은 정상적인 핵형을 가지며 만능성에 대한 현재 표준을 충족합니다. 연구자들은 작은 분자를 사용하여 Wnt/β-카테닌 신호 전달의 시간적 조절에 기반한 최근 기술된 방법을 사용하여 iPS 세포를 심장 계통으로 성공적으로 분화했습니다. 예비 데이터는 조사자가 심장 분화의 고순도 및 효율성을 생성할 수 있음을 시사합니다. LQT2 환자의 iPS 세포와 관련하여 연구자들은 hERG A561P 돌연변이가 트래픽킹 결함으로 이어져 IKr 전류가 감소하고 결과적으로 활동 전위 연장 및 세포성 부정맥(초기 탈분극 후)을 유발함을 보여주었습니다.

모든 iPS 세포주의 획득 및 검증 시 프로젝트의 첫 번째 단계는 CIQTP와 관련된 심장 유전자 발현 프로파일의 식별로 구성됩니다. 이를 위해 연구자들은 대조군과 환자 유래 iPS 세포(28일)에서 분화된 심근세포를 사용하여 우리 연구실의 Genomics 핵심 시설과 협력하여 RNA 염기서열 분석을 수행할 것입니다. 조사관은 또한 기본 조건 하에서 그리고 약물 유도 아드레날린성 자극 후에 자동 패치 클램프 및 광학 기반(CellOptiq®) 기술을 사용하여 높은 처리량의 활동 전위 및 이온 전류 분석을 수행합니다. 이러한 모든 분석을 종합하면 인간 심근세포에서 CIQTP와 관련된 전기생리학적 프로필을 처음으로 식별할 수 있습니다. 이 분석을 통해 연구자들은 CIQTP와 관련된 변경된 유전자 발현 프로그램을 결함이 있는 심장 생리학에 연결할 수 있습니다.

iPSC 심장 분화 프로토콜: 세포는 Matrigel 코팅 플레이트에서 배양되고 심인성 사이토카인: CHIR 및 IWR-1에 노출됩니다. 박동 식민지는 약 10일 후에 나타납니다. 20일 후, 세포는 10일 후 전기생리학적 분석을 위해 해리되고 다시 파종됩니다. 마지막으로, 분화 28일 후, RNA seq 분석을 위해 박동 세포를 수집할 것이다.

전체 전사체 시퀀싱(RNAseq): 각 iPS 세포주의 2개 클론으로부터 3분할 28일째에 박동 iPSC-CM을 수집하고 Macherey-Nagel 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다. 샘플의 각 RNA의 존재와 양은 차세대 시퀀싱(Illumina HiSeq 기술)을 사용하여 평가됩니다. Bioinformatics 분석은 우리 연구실의 BIRD 핵심 시설에서 수행됩니다.

자동 패치 클램프에 의한 이온 전류 기록: CIQTP의 재분극 결함은 전체 세포 패치 클램프를 사용하여 기록되는 특정 이온 전류(나트륨 전류, INa, 칼슘 전류, ICa,L 및 칼륨 전류, IK 및 IKr)의 기능 장애를 반영할 수 있습니다.

활동 전위 기록: 이 기록은 2가지 기술을 사용하여 수행됩니다.

1. 격리된 박동 세포는 37oC에서 amphotericin B와 함께 천공된 패치-클램프 기술을 사용하여 분석됩니다. 패치 피펫은 세포내액과 유사한 이온 구성을 가진 용액으로 채워집니다.
2. CellOptiq® 기술(Clyde Biosciences)을 사용하여 전압에 민감한 염료로 5 µmol/L di-8-ANEPPS를 사용하여 분화 28일 후 심근세포에서 활동 전위 광학 기록을 수행합니다. 세포는 염료의 2시간 배양 및 기록 중에 37°C, 5% CO2 및 20% O2에서 배양됩니다.