CIQTP-Verlängerung: Rolle und Mechanismus beim plötzlichen Herztod (IQARE-SCD)

Der plötzliche Herztod (SCD) ist eine der Haupttodesursachen in Industrieländern. In Frankreich sterben jedes Jahr schätzungsweise 40.000 bis 50.000 Menschen plötzlich. Die meisten dieser Todesfälle betreffen ältere Menschen und stehen im Zusammenhang mit Erkrankungen der Herzkranzgefäße. Allerdings sterben in Frankreich jedes Jahr schätzungsweise 4000 bis 5000 Personen zwischen 1 und 45 Jahren plötzlich. SCD tritt häufig bei jungen Opfern ohne identifizierbare EKG-Anomalien und ohne strukturelle Defekte auf. Folglich bleiben die meisten SCD-Ereignisse bei jungen Erwachsenen ungeklärt und werden in eine schwer fassbare Gruppe eingeordnet, die als idiopathisches Kammerflimmern (IVF) bekannt ist.

Der Forscher identifizierte kürzlich eine neue arrhythmische Entität (Katecholamin-induzierte QT-Verlängerung; CIQTP), die für SCD verantwortlich ist und durch eine normale QT-Dauer in Ruhe, aber eine starke QT-Verlängerung während eines mentalen Belastungstests gekennzeichnet ist. Das Ziel dieses translationalen Projekts ist es, die Prävalenz dieses neuen Phänotyps einer seltenen Erkrankung bei ungeklärter SCD zu bestimmen und den zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismus zu identifizieren.

Die Verwendung von mentalen Belastungstests könnte auf andere erbliche arrhythmische Erkrankungen wie das Long-QT-Syndrom ausgedehnt werden. Angesichts der Möglichkeit, neue betroffene Verwandte zu identifizieren, kann dies zu einer signifikanten Verringerung des Risikos eines Wiederauftretens des plötzlichen Herztodes in einer Familie führen.

Das Hauptanliegen dieses Projekts ist die Beschreibung der klinischen Auswirkungen und des pathophysiologischen Mechanismus dieses neuen Syndroms, das zu SCD führt.

Basierend auf unserer jüngsten Beschreibung dieser Katecholamin-induzierten QT-Verlängerung stellen die Forscher folgende Hypothese auf:

• Dieses Syndrom ist teilweise an den 60 % der nicht diagnostizierten familiären IVF nach einem vollständigen familiären Screening beteiligt7. Da das Grundlinien-EKG ohne MST normal ist, kann die Identifizierung solcher klinischen Merkmale durch einen mentalen Belastungstest bei Probanden und Verwandten durchgeführt werden, die zuvor als nicht von erblicher arrhythmischer Erkrankung betroffen angesehen wurden.
• Ein mentaler Belastungstest hilft, Grenzfälle anderer erblicher Arrhythmien wie des Long-QT-Syndroms zu identifizieren. Tatsächlich ist diese vererbte Arrhythmie durch eine genetisch bedingte Verlängerung des QT-Intervalls gekennzeichnet, die im Ausgangs-EKG beobachtet wird, jedoch weisen mehr als ein Drittel der Patienten nur eine leichte QT-Verlängerung bei Ausgangsuntersuchung auf. Folglich fordern sie den Einsatz von Provokationstests (z. Belastungstest und Adrenalintest), um eine pathologische QT-Verlängerung zu demaskieren18. Der Prüfarzt geht davon aus, dass MST dazu beitragen kann, diese QT-Verlängerung zu entlarven.
• Basierend auf dem autosomalen Vererbungsmodus, der kürzlich für diese Krankheit beschrieben wurde, stellt der Forscher die Hypothese auf, dass dieses Syndrom zu den Mendelschen Störungen gehört. Daher schlagen die Forscher vor, einen familiären Ansatz anzuwenden, um die wichtigsten Gene zu identifizieren, die mit dem CIQTP-Syndrom assoziiert sind.

Ziel dieses Projekts ist die Beschreibung der klinischen Auswirkungen und des pathophysiologischen Mechanismus dieses neuen Syndroms, das zum plötzlichen Herztod führt. Genauer gesagt zielen die Ermittler darauf ab:

• Bestimmung der Prävalenz von CIQTP bei ungeklärter SCD und Identifizierung neuer großer betroffener Familien
• die Rolle von psychischem Stress bei der QT-Verlängerung zu identifizieren
• mit der Krankheit assoziierte Gene zu identifizieren, indem die Gesamtgenomsequenzierung und die Analyse der Identität nach Abstammung in großen Familien kombiniert werden
• Transkriptomische und elektrophysiologische Profilerstellung von Kardiomyozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-CM) von CIQTP-Patienten durchführen, um mutmaßliche Biomarker und pathophysiologische Mechanismen zu identifizieren.

Basierend auf diesem translationalen Ansatz wollen die Forscher die Pathophysiologie und die klinische Implikation von CIQTP beim plötzlichen Herztod beschreiben. Die Beschreibung dieses neuen Syndroms mit einem innovativen Ansatz wie der Sequenzierung des gesamten Genoms und der iPSC-CM-Profilierung kann einen umfassenden und großen Fortschritt auf dem Gebiet der ungeklärten SCD bringen. Über die Identifizierung und Betreuung neu betroffener Angehöriger hinaus kann es helfen, eine genetisch/pathophysiologisch basierte Therapie zu definieren.

Die Forscher haben bereits bewiesen, dass MST ein hocheffizientes diagnostisches Instrument ist, um dieses neue Syndrom zu erkennen, und die Forscher glauben, dass es auch dazu beitragen kann, die QT-Verlängerung bei Trägern von stillen LQTS-Mutationen zu entlarven. MST hat den Vorteil, dass es schnell und einfach anzuwenden ist. Es könnte daher von großem Interesse sein, die familiäre Segregation für ungeklärte elektrische Herzfehler aufzudecken, die autosomal dominant vererbt werden. Es könnte zusätzlich die offensichtliche Nicht-Penetranz verringern, die bei LQTS auftritt.

Aufgaben des Projektes

Aufgabe 1: Bestimmen Sie die Prävalenz von CIQTP bei ungeklärter SCD und identifizieren Sie neue betroffene Familien

Die meisten SCD-Fälle vor dem 45. Lebensjahr bleiben ungeklärt und sind wahrscheinlich auf eine erbliche Arrhythmie zurückzuführen6. Nach ungeklärter SCD werden alle aufeinanderfolgenden Familien, die an die Universitätskliniken Nantes, Rennes, Tours oder Brest überwiesen werden, in die Studie aufgenommen.

Alle verfügbaren klinischen Probandendaten werden von den überweisenden Ärzten und Angehörigen erhoben. Wenn die Autopsie durchgeführt wird, werden die Probanden, deren Diagnose erreichbar ist, von der Studie ausgeschlossen.

Familienscreening Nach ungeklärter SCD vor dem 45. Lebensjahr wird ein Familienscreening bei Verwandten ersten Grades durchgeführt und bei positivem Ergebnis auf andere Verwandte ausgedehnt. Wenn keine Verwandten ersten Grades für das Screening verfügbar sind, wird es bei entfernteren Verwandten durchgeführt.

Das klinische Screening umfasst eine Überprüfung der bisherigen Krankengeschichte, eine klinische Untersuchung und ein Ausgangs-EKG. In Ermangelung einer Diagnose nach dieser ersten Untersuchungsreihe Belastungstest, transthorakales Echokardiogramm (TTE), Natriumkanalblocker-Provokation (SCBC) entweder mit Ajmalin (1 mg/kg) oder Flecainid (2 mg/kg) und einem Epinephrin-Test23, 24 wird durchgeführt. Zusätzlich wird ein mentaler Belastungstest durchgeführt, um die QT-Verlängerung mit einem normalen Ausgangs-EKG 25 zu demaskieren.

Mentales Belastungstestprotokoll (Anhang 2) MST wird wie folgt durchgeführt. Die Patienten werden ohne Erklärung zum Ablauf des Tests in Rückenlage gebracht. Das EKG wird zu Studienbeginn und dauerhaft während des Tests aufgezeichnet. MST wird dann entsprechend dem Bildungsstand des Patienten (Kopfrechnen, Geographie oder Namen von Disney-Figuren für Kinder) abrupt durchgeführt, wobei korrekte und schnelle Antworten erforderlich sind. MST wird als relevant angesehen, wenn die Herzfrequenz um mindestens 20 Schläge pro Minute ansteigt. Wenn die Herzfrequenz nicht um 20 Schläge pro Minute ansteigt, gilt der Test als nicht interpretierbar, es sei denn, es wird eine signifikante Verlängerung der QTc festgestellt. MST dauert normalerweise weniger als 2 Minuten. 30 Minuten nach Ende des Tests wird ein neues EKG aufgezeichnet, um zu versuchen, eine EKG-Kurve mit der niedrigsten Herzfrequenz zu erhalten.

Diagnose

Das zu Beginn, während des Belastungstests und während des pharmakologischen Tests durchgeführte EKG wird von zwei Ärzten überprüft, die für den klinischen und genetischen Status blind sind. Alle Daten werden in einer Kerndatenbank gesammelt.

Die Diagnosekriterien entsprachen den Leitlinien der letzten Konsensuskonferenz24,26. Die Prüfärzte werden zusätzlich ein Delta QTm > 30 ms während Epinephrin oder dem mentalen Belastungstest und ein Delta QTc > 30 ms 3 Minuten nach dem Belastungstest als ausreichend für die Diagnose von LQTS betrachten 27,28.

Zwischen jedem Test wird ein Mindestintervall von 30 Minuten eingehalten, um die Katecholamin-Clearance zu ermöglichen. Alle Tests werden mindestens 5 Tage nach Unterbrechung jeder Behandlung durchgeführt, die die Tests beeinträchtigen könnte.

Diese Studie wird gemäß den europäischen Richtlinien für klinische und genetische Forschung durchgeführt. Die Genehmigung des Protokolls wird von institutionellen Ethikkommissionen eingeholt. Von jedem Patienten, der der Teilnahme an der klinischen und genetischen Studie zugestimmt hat, wird eine schriftliche Zustimmung nach Aufklärung eingeholt.

Statistische Analyse Statistische Analysen werden mit der Software Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York) durchgeführt. Kategoriale Variablen werden mit ihren Zahlen und Prozentsätzen dargestellt. Der Chi-Quadrat- oder exakte Fisher-Test (basierend auf der erwarteten Häufigkeit) wird verwendet, um kategoriale Variablen zwischen Gruppen zu vergleichen.

Quantitative Variablen werden als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (25.; 75.) dargestellt. Die Analyse kontinuierlicher Variablen wird unter Verwendung eines t-Tests oder eines Mann-Whitney-Tests basierend auf der Verteilung durchgeführt. Vergleiche zwischen Familien werden unter Verwendung des innerfamiliären Mittelwerts oder des Medians einer kontinuierlichen Variablen durchgeführt, um die Tendenz zur Familiengröße zu begrenzen. Ein zweiseitiger P-Wert von weniger als 0,05 gilt als Hinweis auf statistische Signifikanz in allen Tests.

Aufgabe 2: Identifizieren Sie die Rolle von psychischem Stress bei der QT-Verlängerung

Um die Rolle von psychischem Stress bei der QT-Verlängerung zu identifizieren, werden die Forscher zusätzlich positive und negative Kontrollgruppen in den Universitätskliniken Nantes, Rennes, Tours oder Brest aufnehmen.

Dies wird in der Einschreibung aufeinander folgender Verwandter von Familien bestehen, die vom Long-QT-Syndrom ohne QT-Verlängerung zu Studienbeginn betroffen sind. Das Ergebnis dieses Tests wird mit einem herkömmlichen Screening unter Verwendung eines Belastungstests und eines Epinephrintests verglichen. Dabei zielen die Forscher darauf ab, Patienten aufzunehmen, die weiter als Träger der wichtigsten genetisch basierten Formen des Long-QT-Syndroms (LQT1, LQT2 und LQT3, positive Kontrollgruppe) definiert sind.

Die Prüfärzte werden zusätzlich eine negative Kontrollgruppe gesunder Patienten mit normalem Ausgangs-EKG, ohne kardiale Strukturanomalien und ohne Medikamente, die die MST stören könnten, aufnehmen. Diese Population wird aus Verwandten von Familien bestehen, die für das Screening auf ungeklärte SCD negativ waren.

Diagnosekriterien und Testprotokoll sind identisch mit denen, die in Aufgabe 1 definiert wurden.

Für jede Messung werden drei aufeinanderfolgende Schläge verwendet und der von den beiden Untersuchern erhaltene Durchschnittswert wird berücksichtigt. Das QT-Intervall wird in DII oder V5 gemessen, vom Beginn des QRS-Komplexes bis zum Ende der T-Welle (definiert als Schnittpunkt der Tangente der T-Welle und der isoelektrischen Linie). Die U-Welle wird von der Messung des QT-Intervalls ausgeschlossen.

Diese Studie wird gemäß den europäischen Richtlinien für klinische und genetische Forschung durchgeführt. Die Genehmigung des Protokolls wird von institutionellen Ethikkommissionen eingeholt. Von jedem Patienten, der der Teilnahme an der klinischen und genetischen Studie zugestimmt hat, wird eine schriftliche Zustimmung nach Aufklärung eingeholt.

Statistische Analysen werden mit der Software Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York) durchgeführt. Vergleiche zwischen den Gruppen werden für jeden klinischen Parameter und jeden EKG-Parameter zu Studienbeginn und während beider Tests (mentaler Belastungstest, Belastungstest, Epinephrintest) durchgeführt. Kategoriale Variablen werden mit ihren Zahlen und Prozentsätzen dargestellt. Der Chi-Quadrat- oder exakte Fisher-Test (basierend auf der erwarteten Häufigkeit) wird verwendet, um kategoriale Variablen zwischen Gruppen zu vergleichen. Quantitative Variablen werden als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (25.; 75.) dargestellt. Die Analyse kontinuierlicher Variablen wird unter Verwendung eines t-Tests oder eines Mann-Whitney-Tests basierend auf der Verteilung durchgeführt. Ein zweiseitiger P-Wert von weniger als 0,05 gilt als Hinweis auf statistische Signifikanz in allen Tests.

Die Ermittler haben bereits eine Population von 30 gesunden Kontrollpersonen und 25 Probanden mit LQTS (LQT1=9 oder LQT2=16), aber mit einem Ruhe-QTc<480 ms, in das Krankenhaus von Nantes aufgenommen. Erste Ergebnisse haben eine Sensitivität von Belastungstest, Epinephrintest und MST von jeweils 60 %, 95 % und 94 % innerhalb der Familien und 76 %, 93 % und 92 % innerhalb der Positivkontrollen bei einer erreichten Spezifität von 100 % identifiziert jede Prüfung. Dies bestätigt, dass der MST-Test für Patienten mit langem QT ohne eindeutige QT-Verlängerung von Interesse sein kann.

Aufgabe 3: Identifizieren Sie spezifische Gene, die mit der Krankheit assoziiert sind

Ziel: Identifizierung seltener Varianten in neuen Genen, die stark zum VF-Risiko innerhalb von Stammbäumen beitragen.

In Nantes wurden vier große IVF-Familien mit 6 SCD (davon 2 wiederbelebt) und 7 unerklärlichen Synkopenepisoden in jungen Jahren charakterisiert. Unter ihnen zeigten jeweils 9, 10, 11 und 4 Familienmitglieder ein verlängertes QT-Intervall nach MST und/oder einem anderen Provokationstest, während alle LQTS-assoziierten Gene negativ waren. Die Beschreibung dieser neuen klinischen Entität wurde kürzlich zur Veröffentlichung im Journal of the American College of Cardiology angenommen17. Das Auftreten von VF/SCD- oder EKG-Anomalien bei genetisch entfernten Personen innerhalb von Familien macht Stammbäume für genetische Studien sehr aussagekräftig, da die Patienten umso weniger Varianten teilen, je größer die genetische Distanz ist. Zu beachten ist, dass zusätzliche Verwandte klinisch untersucht werden (Personen mit Fragezeichensymbolen auf den Stammbäumen unten) und die Aussagekraft der genetischen Studie erhöhen können. Frühere Arbeiten der Gruppe von J. Barc und Nantes demonstrierten unsere Fähigkeit, solche ehrgeizigen Projekte zu leiten, insbesondere zur Genentdeckung, die auf einem familiären Ansatz in Verbindung mit der Sequenzierung der nächsten Generation basiert.

Aufgabe3.1: Genotypisierung des gesamten Genoms und Analyse der betroffenen Familienmitglieder Ziel: Identifizierung einer genomischen Region, die den betroffenen Familienmitgliedern gemeinsam ist.

Die genomweite Genotypisierung aller betroffenen Familienmitglieder wird mit Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) Plate on Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel durchgeführt, einem Instrument, das über die genomische Kerneinrichtung unseres Labors in Nantes erhältlich ist. Genomische Regionen, die von betroffenen Familienmitgliedern geteilt werden, werden wie zuvor beschrieben durch Identity By Descent (IBD)-Analyse bewertet. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Genomregion zu verfeinern, in der sich die kausale Variante befindet. Aufgrund der Größe der Familien können die Forscher davon ausgehen, dass aus dieser Analyse eine relativ kleine genomische Region hervorgeht. Aufmerksamkeit wird potentiellen gemeinsamen Regionen zwischen Familien gewidmet, die ein potentielles gemeinsames Gen anzeigen würden.

Aufgabe3.2: Gesamtgenomsequenzierung und -analyse Ziel: Identifizierung seltener Varianten unter den genomischen Regionen, die von betroffenen Familienmitgliedern gemeinsam genutzt werden.

Hier sollen die Ermittler eine Genomsequenzierung bei 3 entfernt verwandten, vom CIQTP-Syndrom betroffenen Personen aus jedem der 4 Stammbäume durchführen. Vorteile der Genomsequenzierung liegen in der Abwesenheit von Einfang- und PCR-Schritten, was die Einfangartefakte und die nicht abgedeckten Regionen stark einschränkt und die Möglichkeit bietet, eine Mutation innerhalb eines wesentlichen regulatorischen Elements aufzudecken, das zur nicht kodierenden Region gehört. Die Sequenzierung wird in Zusammenarbeit mit dem National Genotyping Center (CEA-CNG) durchgeführt. Die NGS-Pipeline folgt den Empfehlungen des Broad Institute GATK „Best Practices“ broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. Grundsätzlich werden Reads mit bwa-mem abgebildet, Duplikate werden mit Picard entfernt, GATK wird verwendet, um die Reads neu auszurichten und neu zu kalibrieren. Die Varianten werden mit HaplotypeCaller aufgerufen und mit GATK neu kalibriert. Die generierten VCFs werden dann mit dem Ensembl Variant Effect-Prädiktor kommentiert. Aus den VCF-Dateien und innerhalb jedes Stammbaums priorisieren die Ermittler Varianten, die von den 3 betroffenen Personen geteilt werden und in gemeinsamen genomischen Regionen (IBD) enthalten sind. Aus den gemeinsam genutzten Varianten konzentrieren sich die Ermittler auf seltene Varianten und filtern dann Varianten heraus, die in der Allgemeinbevölkerung verbreitet sind (Minor-Allel-Häufigkeit > 0,1 %). Zu diesem Zweck werden die Ermittler öffentliche und interne Exom-/Genom-Datenbanken verwenden, die insgesamt etwa 130 000 Exome und 20 000 Genome sammeln, wie z -www.vacarme-project.org). Dies wird voraussichtlich zu einer Auswahlliste von wenigen "Kandidaten"-Varianten/Genen pro Familie führen. Eine bioinformatische Vorhersage ihrer funktionellen Wirkung wird von den Programmen SIFT und Polyphen2 bewertet, um mutmaßliche maligne Varianten unter diesen hervorzuheben. Die Ermittler validieren alle so durch Sanger-Sequenzierung identifizierten Varianten und untersuchen ihre Co-Segregation mit anderen betroffenen Familienmitgliedern in den jeweiligen Stammbäumen. Die Erfahrung der Kerneinrichtung für Genomik und Bioinformatik in Nantes unseres Labors, die als französische nationale Infrastrukturen für Genomik (IBiSA) und Bioinformatik (Institut Français de Bioinformatique) anerkannt sind, sowie unsere Erfahrung im NGS-Datenmanagement werden die Machbarkeit dieser Aufgabe sicherstellen. Darüber hinaus läuft in unserer Gruppe ein großes Genomsequenzierungsprojekt, an dem mehr als 1000 Gesamtgenome (einschließlich Herzpatienten und Personen aus der Allgemeinbevölkerung) teilnehmen. Die Erfahrungen aus diesem Projekt werden die Effizienz der Analyse von Aufgabe Nr. 3 und die Erfolgsaussichten verstärken.

Aufgabe 4: Transkriptomische und elektrophysiologische Profilerstellung von Kardiomyozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen von CIQTP-Patienten durchführen, um mutmaßliche Biomarker und pathophysiologische Mechanismen zu identifizieren

Die Forscher stellen die Hypothese auf, dass induzierte, aus pluripotenten Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten (iPSC-CMs), die von CIQPT-Patienten generiert werden, es uns ermöglichen, die globalen Genexpressionsänderungen und elektrophysiologischen Veränderungen im Zusammenhang mit der Krankheit zu identifizieren. Dazu zielen die Ermittler darauf ab, iPSC-CMs zu vergleichen, die von Mitgliedern der 4 in Aufgabe 3 beschriebenen Familien generiert wurden. Innerhalb jedes Stammbaums wählen die Ermittler eine gesunde „Kontrolle“ (ohne familiäre QT-Verlängerung) und 2 CIPQT-Patienten aus.

Positive LQT-Kontroll- und negative gesunde Kontroll-iPS-Zelllinien wurden bereits generiert und in Nantes im Zusammenhang mit einer früheren Studie zu LQT2 untersucht, die die Machbarkeit dieser Aufgabe demonstrierte. Dies bietet auch die Möglichkeit, die transkriptomische und elektrophysiologische Signatur von CIPQT mit der von LTQ2 zu vergleichen. Für jede Linie wurden 3 iPS-Zellklone validiert: Alle Linien haben einen normalen Karyotyp und erfüllen die aktuellen Standards für Pluripotenz. Die Forscher differenzierten die iPS-Zellen mithilfe einer kürzlich beschriebenen Methode, die auf der zeitlichen Modulation der Wnt/ß-Catenin-Signalübertragung mit kleinen Molekülen basiert, erfolgreich in die kardiale Linie. Vorläufige Daten deuten darauf hin, dass die Forscher eine hohe Reinheit und Effizienz der kardialen Differenzierung erzeugen können. In Bezug auf die iPS-Zellen des LQT2-Patienten zeigten die Forscher, dass die hERG-A561P-Mutation zu einem Trafficking-Defekt führt, der zu einem reduzierten IKr-Strom und folglich zu einer Verlängerung des Aktionspotentials und zellulären Arrhythmien (frühe Nachdepolarisationen) führt.

Nach Erhalt und Validierung aller iPS-Zelllinien besteht der erste Schritt des Projekts in der Identifizierung des mit CIQTP assoziierten kardialen Genexpressionsprofils. Dazu werden die Forscher in Zusammenarbeit mit der Genomics Core Facility unseres Labors Kardiomyozyten verwenden, die aus Kontroll- und Patienten-abgeleiteten iPS-Zellen (Tag 28) differenziert wurden, um RNA-Seq-Analysen durchzuführen. Die Forscher werden auch Hochdurchsatz-Aktionspotential- und Ionenstromanalysen unter Verwendung automatisierter Patch-Clamp- und optischer (CellOptiq®) Techniken unter Ausgangsbedingungen und nach arzneimittelinduzierter adrenerger Stimulation durchführen. Zusammengenommen werden uns diese Analysen die erste Identifizierung des elektrophysiologischen Profils liefern, das mit CIQTP in menschlichen Kardiomyozyten assoziiert ist. Mit dieser Analyse werden die Forscher in der Lage sein, das CIQTP-assoziierte veränderte Genexpressionsprogramm mit einer fehlerhaften Herzphysiologie in Verbindung zu bringen.

iPSC-Herzdifferenzierungsprotokolle: Zellen werden auf einer Matrigel-beschichteten Platte kultiviert und kardiogenen Zytokinen ausgesetzt: CHIR und IWR-1. Schlagende Kolonien erscheinen nach etwa 10 Tagen. Nach 20 Tagen werden die Zellen getrennt und 10 Tage später für elektrophysiologische Analysen erneut ausgesät. Schließlich werden nach 28 Tagen Differenzierung schlagende Zellen für die RNA-Seq-Analyse gesammelt.

Sequenzierung des gesamten Transkriptoms (RNAseq): Schlagen von iPSC-CMs nach 28 Tagen von 3 Differenzierungen von 2 Klonen jeder iPS-Zelllinie werden gesammelt und RNA wird mit dem Macherey-Nagel-Kit extrahiert. Das Vorhandensein und die Menge jeder RNA der Proben werden dann mithilfe der Sequenzierung der nächsten Generation (Illumina HiSeq-Technologie) bewertet. Bioinformatische Analysen werden von der BIRD Core Facility unseres Labors durchgeführt.

Ionenstromaufzeichnungen durch automatisierte Patch-Clamp: Die Repolarisationsdefekte von CIQTP spiegeln wahrscheinlich die Dysfunktion bestimmter Ionenströme wider, die mit Whole Cell Patch-Clamp aufgezeichnet werden: Natriumstrom, INa, Calciumstrom, ICa, L und Kaliumströme, IKs und IKr.

Aktionspotential-Aufzeichnung: Diese Aufzeichnung wird mit 2 Techniken durchgeführt.

1. Isolierte schlagende Zellen werden unter Verwendung der perforierten Patch-Clamp-Technik mit Amphotericin B bei 37 °C analysiert. Patch-Pipetten werden mit einer Lösung gefüllt, die eine ionische Zusammensetzung ähnlich der intrazellulären Flüssigkeit hat.
2. Optische Aufzeichnungen des Aktionspotentials werden an Kardiomyozyten nach 28 Tagen Differenzierung mit 5 µmol/L di-8-ANEPPS als spannungssensitivem Farbstoff unter Verwendung der CellOptiq®-Technologie (Clyde Biosciences) durchgeführt. Die Zellen werden bei 37 °C, 5 % CO2 und 20 % O2 während der 2-stündigen Inkubation des Farbstoffs und während der Aufzeichnung inkubiert.