Prolongación CIQTP: papel y mecanismo en la muerte súbita cardíaca (IQARE-SCD)

La muerte súbita cardíaca (MSC) es una de las principales causas de muerte en los países desarrollados. Se estima que entre 40.000 y 50.000 personas mueren repentinamente cada año en Francia. La mayoría de estas muertes involucran a personas mayores y están relacionadas con la enfermedad de las arterias coronarias. Sin embargo, se estima que entre 4000 y 5000 personas de entre 1 y 45 años mueren repentinamente cada año en Francia. La SCD a menudo ocurre en víctimas jóvenes sin anomalías identificables en el ECG y sin defectos estructurales. En consecuencia, la mayoría de los eventos de SCD en el adulto joven siguen sin explicación y se clasifican en un grupo esquivo conocido como fibrilación ventricular idiopática (FIV).

El investigador identificó recientemente una nueva entidad arrítmica (prolongación del intervalo QT inducida por catecolaminas; CIQTP) responsable de la SCD y caracterizada por una duración normal del intervalo QT en reposo, pero un mayor alargamiento del intervalo QT durante la prueba de esfuerzo mental. El objetivo de este proyecto traslacional es determinar la prevalencia de este nuevo fenotipo de enfermedad rara en la ECF inexplicable e identificar su mecanismo fisiopatológico subyacente.

El uso de la prueba de estrés mental podría extenderse a otras enfermedades arrítmicas hereditarias como el síndrome de QT largo. Dado el potencial de identificación de nuevos familiares afectados, puede conducir a una reducción significativa del riesgo de recurrencia de muerte súbita cardíaca en una familia.

El objetivo principal de este proyecto es describir la implicación clínica y el mecanismo fisiopatológico de este nuevo síndrome que conduce a la MSC.

Con base en nuestra descripción reciente de esta prolongación del intervalo QT inducida por catecolaminas, los investigadores plantean la hipótesis de que:

• Este síndrome está parcialmente implicado en el 60% de las FIV familiares no diagnosticadas tras un cribado familiar completo7. De hecho, dado que el ECG inicial es normal sin MST, la identificación de tales características clínicas puede realizarse mediante una prueba de esfuerzo mental en probandos y familiares considerados previamente como no afectados por la enfermedad arrítmica hereditaria.
• La prueba de estrés mental ayudará a identificar los casos límite de otras arritmias hereditarias, como el síndrome de QT largo. De hecho, esta arritmia hereditaria se caracteriza por una prolongación genética del intervalo QT observada en el ECG inicial; sin embargo, más de un tercio de los pacientes presentan solo una ligera prolongación del intervalo QT al inicio. En consecuencia, requieren el uso de pruebas de provocación (p. prueba de esfuerzo y prueba de adrenalina) para desenmascarar la prolongación QT patológica18. El investigador plantea la hipótesis de que la MST puede ayudar a desenmascarar esta prolongación del intervalo QT.
• Con base en el modo de herencia autosómica que el investigador describió recientemente para esta enfermedad, el investigador plantea la hipótesis de que este síndrome pertenece a los trastornos mendelianos. Por lo tanto, los investigadores proponen aplicar un enfoque familiar para identificar los principales genes asociados con el síndrome CIQTP.

El objetivo de este proyecto es describir la implicación clínica y el mecanismo fisiopatológico de este nuevo síndrome que conduce a la muerte súbita cardiaca. Más específicamente, los investigadores pretenden:

• determinar la prevalencia de CIQTP en SCD inexplicable e identificar nuevas familias numerosas afectadas
• identificar el papel del estrés mental en la prolongación del intervalo QT
• identificar genes asociados a la enfermedad combinando la secuenciación del genoma completo y el análisis de Identity By Descent en familias numerosas
• realizar perfiles transcriptómicos y electrofisiológicos de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-CM) de pacientes con CIQTP para identificar supuestos biomarcadores y mecanismos fisiopatológicos.

Sobre la base de este enfoque traslacional, los investigadores tienen como objetivo describir la fisiopatología y la implicación clínica de CIQTP en la muerte súbita cardíaca. La descripción de este nuevo síndrome utilizando un enfoque innovador, como la secuenciación del genoma completo y el perfilado de iPSC-CM, puede proporcionar un progreso integral e importante en el campo de la SCD inexplicable. Más allá de la identificación y el cuidado de los familiares recién afectados, puede ayudar a definir una terapia basada en la genética/fisiopatología.

Los investigadores ya demostraron que la MST es una herramienta diagnóstica muy eficaz para detectar este nuevo síndrome, y creen que también puede ayudar a desenmascarar la prolongación del intervalo QT en portadores de mutaciones silenciosas en LQTS. MST tiene la ventaja de ser rápido y simple de aplicar. Por lo tanto, podría ser de gran interés descubrir la segregación familiar de defectos eléctricos cardíacos inexplicables que muestran una transmisión autosómica dominante. Además, podría disminuir la falta de penetración aparente encontrada en LQTS.

tareas del proyecto

Tarea 1: determinar la prevalencia de CIQTP en SCD inexplicable e identificar nuevas familias afectadas

La mayoría de los casos de SCD antes de los 45 años siguen sin explicación y es probable que se deban a una enfermedad arrítmica hereditaria6. Después de una MSC inexplicable, se incluirán en el estudio todas las familias consecutivas remitidas a los hospitales universitarios de Nantes, Rennes, Tours o Brest.

Todos los datos de probandos clínicos disponibles se recopilarán de los médicos remitentes y familiares. Cuando se realice la autopsia, los probandos cuyo diagnóstico sea factible serán excluidos del estudio.

Cribado familiar Después de una SCD inexplicable antes de los 45 años, el cribado familiar se realizará en familiares de primer grado y luego se extenderá a otros familiares si es positivo. Cuando no se disponga de familiares de primer grado para el cribado, se realizará en familiares más lejanos.

La evaluación clínica incluirá una revisión del historial médico anterior, un examen clínico y un ECG inicial. En ausencia de diagnóstico después de este primer conjunto de exámenes, prueba de esfuerzo, ecocardiograma transtorácico (TTE), desafío con bloqueadores de los canales de sodio (SCBC) ya sea con ajmalina (1 mg/kg) o flecainida (2 mg/kg) y una prueba de epinefrina23, 24 se realizará. Además, se realizará una prueba de esfuerzo mental para desenmascarar la prolongación del intervalo QT con un ECG basal normal de 25.

Protocolo de prueba de estrés mental (apéndice 2) MST se realizará de la siguiente manera. Los pacientes serán colocados en posición supina sin ninguna explicación sobre el curso de la prueba. El ECG se registrará al inicio y de forma permanente durante la prueba. La MST se realizará entonces de forma abrupta según el nivel de educación del paciente (cálculo mental, geografía o nombres de personajes de Disney para niños) con exigencia de respuestas correctas y rápidas. La MST se considerará relevante en presencia de un aumento de la frecuencia cardíaca de al menos 20 latidos por minuto. En caso de ausencia de un aumento de la frecuencia cardíaca de 20 latidos por minuto, la prueba se considerará no interpretable a menos que se identifique una prolongación significativa del QTc. MST generalmente dura menos de 2 minutos. Se registrará un nuevo ECG 30 minutos después del final de la prueba en un intento de obtener un trazo de ECG con la frecuencia cardíaca más baja.

Diagnóstico

El ECG realizado al inicio del estudio, durante la prueba de esfuerzo y durante la prueba farmacológica será revisado por dos médicos ciegos al estado clínico y genético. Todos los datos se recopilarán en una base de datos central.

Los criterios diagnósticos se adhirieron a las guías de la última conferencia de consenso24,26. Los investigadores considerarán además un delta QTm > 30 ms durante la prueba de epinefrina o de esfuerzo mental y un delta QTc > 30 ms 3 min después de la prueba de esfuerzo, como suficientes para el diagnóstico de LQTS 27,28.

Se observará un intervalo mínimo de 30 minutos entre cada prueba para permitir la depuración de catecolaminas. Todas las pruebas se realizarán al menos 5 días después de interrumpir cada tratamiento que pudiera interferir con las pruebas.

Este estudio se lleva a cabo de acuerdo con las directrices europeas para la investigación clínica y genética. La aprobación del protocolo se obtendrá de los comités de ética institucionales. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito de cada paciente que aceptó participar en el estudio clínico y genético.

Análisis estadístico Los análisis estadísticos se realizarán con el software Social Science® (IBM Corp., Armonk, Nueva York). Las variables categóricas se presentarán con sus números y porcentajes. Se utilizará la prueba de chi-cuadrado o exacta de Fisher (basada en la frecuencia esperada) para comparar variables categóricas entre grupos.

Las variables cuantitativas se presentarán como media ± desviación estándar o mediana (25; 75). El análisis de variables continuas se realizará utilizando una prueba t o prueba de Mann Whitney basada en la distribución. Las comparaciones entre familias se realizarán utilizando el valor medio intrafamiliar o la mediana de la variable continua para limitar el sesgo hacia el tamaño de la familia. Se considerará que un valor P bilateral de menos de 0,05 indica significancia estadística en todas las pruebas.

Tarea 2: identificar el papel del estrés mental en la prolongación del intervalo QT

Para identificar el papel del estrés mental en la prolongación del intervalo QT, los investigadores inscribirán adicionalmente grupos de control positivo y negativo en los hospitales universitarios de Nantes, Rennes, Tours o Brest.

Consistirá en el enrolamiento de familiares consecutivos de familias afectadas por síndrome de QT largo sin prolongación del QT al inicio del estudio. El resultado de esta prueba se comparará con la prueba de detección convencional mediante prueba de esfuerzo y prueba de epinefrina. Por lo tanto, los investigadores tienen como objetivo inscribir a los pacientes definidos como portadores de las principales formas genéticas del síndrome de QT largo (LQT1, LQT2 y LQT3, grupo de control positivo).

Los investigadores inscribirán además a un grupo de control negativo de pacientes sanos con ECG basal normal, sin anomalías estructurales cardíacas y sin ningún medicamento que pueda interferir con el MST. Esta población consistirá en familiares de familias negativas para el tamizaje de SCD inexplicable.

Los criterios de diagnóstico y el protocolo de prueba serán idénticos a los definidos en la tarea 1.

Se utilizarán tres latidos consecutivos para cada medición y se tendrá en cuenta el valor medio obtenido por los dos investigadores. El intervalo QT se medirá en DII o V5, desde el inicio del complejo QRS hasta el final de la onda T (definida como la intersección de la tangente de la onda T y la línea isoeléctrica). La onda U se excluirá de la medición del intervalo QT.

Este estudio se lleva a cabo de acuerdo con las directrices europeas para la investigación clínica y genética. La aprobación del protocolo se obtendrá de los comités de ética institucionales. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito de cada paciente que aceptó participar en el estudio clínico y genético.

Los análisis estadísticos se realizarán con el software Social Science® (IBM Corp., Armonk, Nueva York). Se realizarán comparaciones entre grupos para cada parámetro clínico y ECG al inicio del estudio y durante ambas pruebas (prueba de estrés mental, prueba de ejercicio, prueba de epinefrina). Las variables categóricas se presentarán con sus números y porcentajes. Se utilizará la prueba de chi-cuadrado o exacta de Fisher (basada en la frecuencia esperada) para comparar variables categóricas entre grupos. Las variables cuantitativas se presentarán como media ± desviación estándar o mediana (25; 75). El análisis de variables continuas se realizará utilizando una prueba t o prueba de Mann Whitney basada en la distribución. Se considerará que un valor P bilateral de menos de 0,05 indica significancia estadística en todas las pruebas.

El investigador ya inscribió en el hospital de Nantes una población de 30 controles sanos y 25 sujetos afectados con LQTS (LQT1=9 o LQT2=16) pero con un QTc en reposo <480 ms. Los primeros resultados han identificado una sensibilidad de la prueba de esfuerzo, prueba de epinefrina y MST respectivamente del 60%, 95% y 94% dentro de las familias, y 76%, 93% y 92% dentro de los controles positivos, para una especificidad del 100% alcanzada para cada prueba Esto confirma que la prueba MST puede ser de interés en pacientes con QT largo sin una clara prolongación del QT.

Tarea 3: identificar genes específicos asociados con la enfermedad

Objetivo: Identificar variantes raras en nuevos genes que contribuyan fuertemente al riesgo de FV dentro de las genealogías.

Se han caracterizado en Nantes cuatro grandes familias de FIV que presentan 6 MSC (con 2 reanimados) y 7 episodios de síncope inexplicables que ocurren a una edad temprana. Entre ellos, 9, 10, 11 y 4 miembros de la familia, respectivamente, muestran un intervalo QT prolongado después de MST y/u otra prueba de provocación, mientras que todos los genes asociados con LQTS fueron negativos. La descripción de esta nueva entidad clínica ha sido recientemente aceptada para su publicación en el Journal of the American College of Cardiology17. La aparición de anomalías de FV/SCD o ECG en individuos genéticamente distantes dentro de las familias hace que los pedigríes sean muy poderosos para los estudios genéticos, ya que cuanto mayor sea la distancia genética, menos variantes compartirán los pacientes. Cabe destacar que se investigará clínicamente a parientes adicionales (individuo con signos de interrogación en los pedigríes a continuación) y puede aumentar el poder del estudio genético. Los trabajos anteriores de J. Barc y el grupo de Nantes demostraron nuestra capacidad para liderar proyectos tan ambiciosos y específicamente en el descubrimiento de genes basados ​​en el enfoque familiar junto con la secuenciación de próxima generación.

tarea 3.1: Genotipado y análisis del genoma completo de los miembros de la familia afectados Objetivo: Identificar una región genómica compartida por los miembros afectados.

El genotipado de todo el genoma en todos los miembros de la familia afectados se realizará utilizando la placa Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) en Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, instrumento disponible a través de la instalación central genómica de Nantes de nuestro laboratorio. Las regiones genómicas compartidas por los miembros de la familia afectados se evaluarán mediante el análisis Identity By Descent (IBD) como se describió anteriormente. Este paso es crucial para refinar la región del genoma donde se encuentra la variante causal. Según el gran tamaño de las familias, los investigadores pueden esperar que de este análisis surja una región genómica relativamente pequeña. Se prestará atención a la posible región compartida entre familias que indicaría un posible gen común.

tarea 3.2: Secuenciación y análisis del genoma completo Objetivo: identificar variantes raras entre las regiones genómicas compartidas por los miembros de la familia afectados.

Aquí, los investigadores llevarán a cabo la secuenciación del genoma en 3 personas lejanamente relacionadas afectadas por el síndrome CIQTP de cada uno de los 4 pedigríes. Las ventajas de la secuenciación del genoma residen en la ausencia de pasos de captura y PCR, limitando fuertemente los artefactos de captura, las regiones no cubiertas y ofreciendo la posibilidad de descubrir una mutación dentro de un elemento regulador esencial perteneciente a la región no codificante. La secuenciación se realizará en colaboración con el Centro Nacional de Genotipado (CEA-CNG). La canalización de NGS sigue las recomendaciones de las "mejores prácticas" de Broad Institute GATK, broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. Básicamente, las lecturas se mapean usando bwa-mem, los duplicados se eliminan usando picard, GATK se usa para realinear y recalibrar las lecturas. Las variantes se llaman con HaplotypeCaller y se recalibran con GATK. Los VCF generados se anotan luego con el predictor Ensembl Variant Effect. A partir de los archivos VCF y dentro de cada pedigrí, los investigadores priorizarán las variantes compartidas por los 3 individuos afectados y contenidas dentro de las regiones genómicas compartidas (IBD). A partir de las variantes compartidas, los investigadores se centrarán en las variantes raras y luego filtrarán las variantes que son comunes en la población general (frecuencia de alelos menores >0,1 %). Para ello, los investigadores utilizarán bases de datos de exomas/genomas públicas e internas que recopilan en total unos 130 000 exomas y 20 000 genomas, como el consorcio gnomAD, 1000Genomes, el Genoma de los Países Bajos y controles demográficos emparejados específicamente del área de Nantes (estudio PREGO -www.vacarme-project.org). Se espera que esto dé como resultado una lista corta de pocas variantes/genes "candidatos" por familia. Los programas SIFT y Polyphen2 evaluarán una predicción bioinformática de su efecto funcional para resaltar variantes malignas putativas entre ellas. Los investigadores validarán todas las variantes identificadas de esta manera mediante la secuenciación de Sanger e investigarán su cosegregación con otros miembros de la familia afectados en los respectivos pedigríes. La experiencia de las instalaciones centrales de genómica y bioinformática de Nantes de nuestro laboratorio, que son reconocidas como infraestructuras nacionales francesas en genómica (IBiSA) y bioinformática (Institut Français de Bioinformatique), junto con nuestra experiencia en la gestión de datos NGS, asegurarán la viabilidad de esta tarea. Además, nuestro grupo está llevando a cabo un gran proyecto de secuenciación del genoma que reúne más de 1000 genomas completos (incluidos pacientes cardíacos e individuos de la población general). La experiencia de este proyecto reforzará la eficiencia del análisis de la tarea n.º 3 y la probabilidad de éxito.

Tarea 4: realizar perfiles transcriptómicos y electrofisiológicos de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas de pacientes con CIQTP para identificar biomarcadores putativos y mecanismos fisiopatológicos

Los investigadores plantean la hipótesis de que los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-CM) generados a partir de pacientes con CIQPT nos permitirán identificar los cambios globales en la expresión génica y las alteraciones electrofisiológicas asociadas con la enfermedad. Para eso, los investigadores tienen como objetivo comparar los iPSC-CM generados a partir de miembros de las 4 familias descritas en la tarea 3. Dentro de cada pedigrí, los investigadores seleccionarán un sujeto sano "control" (que no presente la prolongación QT familiar) y 2 pacientes CIPQT.

Las líneas celulares iPS de control positivo LQT y control negativo sano ya se generaron y estudiaron en Nantes en el contexto de un estudio previo sobre LQT2 que demuestra la viabilidad de esta tarea. Esto también ofrecerá la oportunidad de comparar la firma transcriptómica y electrofisiológica de CIPQT con las de LTQ2. Para cada línea, se han validado 3 clones de células iPS: todas las líneas tienen cariotipo normal y cumplen con los estándares actuales de pluripotencialidad. Los investigadores lograron diferenciar las células iPS en el linaje cardíaco, usando un método recientemente descrito basado en la modulación temporal de la señalización de Wnt/ß-catenina usando moléculas pequeñas. Los datos preliminares sugieren que los investigadores pueden generar alta pureza y eficiencia de la diferenciación cardíaca. Con respecto a las células iPS del paciente LQT2, los investigadores demostraron que la mutación hERG A561P conduce a un defecto de tráfico que da como resultado una corriente IKr reducida y, en consecuencia, una prolongación del potencial de acción y arritmias celulares (posdespolarizaciones tempranas).

Una vez obtenidas y validadas todas las líneas celulares iPS, el primer paso del proyecto consistirá en la identificación del perfil de expresión del gen cardíaco asociado al CIQTP. Para ello, los investigadores utilizarán cardiomiocitos diferenciados de células iPS de control y derivadas de pacientes (día 28) para realizar análisis de secuenciación de ARN, en colaboración con el centro de genómica de nuestro laboratorio. Los investigadores también realizarán análisis de potencial de acción y de corriente iónica de alto rendimiento utilizando técnicas automatizadas de abrazadera de parche y de base óptica (CellOptiq®) en condiciones de referencia y después de la estimulación adrenérgica inducida por fármacos. Todos combinados, estos análisis nos proporcionarán la primera identificación del perfil electrofisiológico asociado con CIQTP en cardiomiocitos humanos. Con este análisis, los investigadores podrán vincular el programa de expresión génica alterada asociado con CIQTP a la fisiología cardíaca defectuosa.

Protocolos de diferenciación cardíaca iPSC: las células se cultivarán en una placa recubierta de Matrigel y se expondrán a citocinas cardiogénicas: CHIR e IWR-1. Las colonias palpitantes aparecen después de unos 10 días. Después de 20 días, las células se disociarán y se volverán a sembrar para análisis electrofisiológicos, 10 días después. Finalmente, después de 28 días de diferenciación, se recolectarán células batientes para análisis de secuencias de ARN.

Secuenciación del transcriptoma completo (RNAseq): superación de iPSC-CM a los 28 días de 3 diferenciaciones de 2 clones de cada línea celular iPS y se extraerá el ARN con el kit Macherey-Nagel. A continuación, se evaluará la presencia y la cantidad de cada ARN de las muestras mediante secuenciación de próxima generación (tecnología Illumina HiSeq). El análisis de bioinformática será realizado por la instalación central BIRD de nuestro laboratorio.

Registros de corriente iónica mediante pinza de parche automatizada: los defectos de repolarización de CIQTP probablemente reflejen la disfunción de corrientes iónicas específicas que se registrarán usando pinza de parche de células enteras: corriente de sodio, INa, corriente de calcio, ICa, L y corrientes de potasio, IK e IKr.

Registro de potencial de acción: Este registro se realizará mediante 2 técnicas.

1. Las células batientes aisladas se analizarán mediante la técnica de pinzamiento de parche perforado con anfotericina B a 37oC. Las pipetas de parche se llenarán con una solución que tenga una composición iónica similar a la del líquido intracelular.
2. Se realizarán grabaciones ópticas de potencial de acción en cardiomiocitos después de 28 días de diferenciación, con 5 µmol/L de di-8-ANEPPS como colorante sensible al voltaje utilizando la tecnología CellOptiq® (Clyde Biosciences). Las células se incubarán a 37 °C, 5 % de CO2 y 20 % de O2 durante las 2 h de incubación del colorante y durante el registro.