Prolungamento CIQTP: ruolo e meccanismo nella morte cardiaca improvvisa (IQARE-SCD)

La morte cardiaca improvvisa (SCD) è una delle principali cause di morte nei paesi sviluppati. Si stima che ogni anno in Francia muoiano improvvisamente da 40.000 a 50.000 persone. La maggior parte di questi decessi coinvolge persone anziane ed è correlata alla malattia coronarica. Tuttavia, ogni anno in Francia muoiono improvvisamente da 4000 a 5000 individui di età compresa tra 1 e 45 anni. La SCD si verifica spesso nelle vittime giovani senza anomalie ECG identificabili e senza difetti strutturali. Di conseguenza, la maggior parte degli eventi di SCD nel giovane adulto rimangono inspiegabili e sono classificati in un gruppo sfuggente noto come fibrillazione ventricolare idiopatica (IVF).

Il ricercatore ha recentemente identificato una nuova entità aritmica (prolungamento del QT indotto da catecolamine; CIQTP) responsabile della SCD e caratterizzata da una normale durata del QT a riposo ma da un maggiore allungamento del QT durante il test di stress mentale. Lo scopo di questo progetto traslazionale è determinare la prevalenza di questo nuovo fenotipo di malattia rara nella SCD inspiegabile e identificarne il meccanismo patofisiologico sottostante.

L'uso del test dello stress mentale potrebbe essere esteso ad altre malattie aritmiche ereditarie come la sindrome del QT lungo. Dato il potenziale di identificazione di nuovi parenti affetti, può portare a una significativa riduzione del rischio di recidiva di morte cardiaca improvvisa in una famiglia.

Il problema principale di questo progetto è quello di descrivere le implicazioni cliniche e il meccanismo fisiopatologico di questa nuova sindrome che porta alla SCD.

Sulla base della nostra recente descrizione di questo prolungamento del QT indotto da catecolamine, i ricercatori ipotizzano che:

• Questa sindrome è in parte coinvolta nel 60% delle IVF familiari non diagnosticate dopo screening familiare completo7. Infatti, poiché l'ECG di base è normale senza MST, l'identificazione di tali caratteristiche cliniche può essere eseguita mediante test di stress mentale in probando e parenti precedentemente considerati non affetti da malattia aritmica ereditaria.
• Il test dello stress mentale aiuterà a identificare i casi limite di altre aritmie ereditarie come la sindrome del QT lungo. In effetti, questa aritmia ereditaria è caratterizzata da un prolungamento su base genetica dell'intervallo QT osservato all'ECG di base, tuttavia più di un terzo dei pazienti presenta solo un leggero prolungamento dell'intervallo QT al basale. Di conseguenza, richiedono l'uso di test di provocazione (ad es. test da sforzo e test dell'adrenalina) per smascherare il prolungamento patologico dell'intervallo QT18. L'investigatore ipotizza che la MST possa aiutare a smascherare questo prolungamento dell'intervallo QT.
• Sulla base della modalità di ereditarietà autosomica recentemente descritta per questa malattia, il ricercatore ipotizza che questa sindrome appartenga ai disturbi mendeliani. Pertanto, i ricercatori propongono di applicare un approccio basato sulla famiglia per identificare i principali geni associati alla sindrome CIQTP.

Lo scopo di questo progetto è quello di descrivere le implicazioni cliniche e il meccanismo fisiopatologico di questa nuova sindrome che porta alla morte cardiaca improvvisa. Più in particolare, gli investigatori mirano a:

• determinare la prevalenza di CIQTP nella SCD inspiegabile e identificare nuove grandi famiglie affette
• identificare il ruolo dello stress mentale nel prolungamento dell'intervallo QT
• identificare i geni associati alla malattia combinando il sequenziamento dell'intero genoma e l'analisi Identity By Descent in famiglie numerose
• eseguire la profilazione trascrittomica ed elettrofisiologica dei cardiomiociti derivati ​​​​da cellule staminali pluripotenti indotti (iPSC-CM) da pazienti CIQTP per identificare biomarcatori putativi e meccanismi fisiopatologici.

Sulla base di questo approccio traslazionale, i ricercatori mirano a descrivere la fisiopatologia e le implicazioni cliniche del CIQTP nella morte cardiaca improvvisa. La descrizione di questa nuova sindrome utilizzando un approccio innovativo come il sequenziamento dell'intero genoma e la profilazione iPSC-CM può fornire un progresso completo e importante nel campo della SCD inspiegabile. Oltre all'identificazione e alla cura dei nuovi parenti affetti, può aiutare a definire una terapia genetica/patofisiologica.

I ricercatori hanno già dimostrato che la MST è uno strumento diagnostico altamente efficiente per rilevare questa nuova sindrome e i ricercatori ritengono che possa anche aiutare a smascherare il prolungamento dell'intervallo QT nei portatori di mutazione LQTS silente. MST ha il vantaggio di essere rapido e semplice da applicare. Potrebbe quindi essere di grande interesse scoprire la segregazione familiare per difetti elettrici cardiaci inspiegabili che mostrano una trasmissione autosomica dominante. Potrebbe inoltre ridurre l'apparente non penetranza riscontrata nella LQTS.

Compiti del progetto

Compito 1: determinare la prevalenza di CIQTP nella SCD inspiegabile e identificare nuove famiglie affette

La maggior parte dei casi di MCI prima dei 45 anni rimane inspiegabile ed è probabile che sia dovuta a malattia aritmica ereditaria6. Dopo SCD inspiegabile, tutte le famiglie consecutive riferite agli ospedali universitari di Nantes, Rennes, Tours o Brest saranno incluse nello studio.

Tutti i dati clinici probandi disponibili saranno raccolti dai medici di riferimento e dai parenti. Quando verrà eseguita l'autopsia, i probandi la cui diagnosi sarà possibile saranno esclusi dallo studio.

Screening familiare Dopo SCD inspiegabile prima dei 45 anni, lo screening familiare verrà eseguito nei parenti di primo grado e poi esteso ad altri parenti se positivi. Quando i parenti di primo grado non sono disponibili per lo screening, verrà eseguito nei parenti più lontani.

Lo screening clinico includerà una revisione della storia medica passata, esame clinico ed ECG di base. In assenza di diagnosi dopo questa prima serie di esami, test da sforzo, ecocardiogramma transtoracico (TTE), test del bloccante dei canali del sodio (SCBC) con ajmalina (1 mg/kg) o flecainide (2 mg/kg) e un test con epinefrina23, 24 verrà eseguito. Verrà inoltre eseguito un test di stress mentale per smascherare il prolungamento dell'intervallo QT con un normale ECG basale 25.

Protocollo del test di stress mentale (appendice 2) L'MST verrà eseguito come segue. I pazienti verranno posti in posizione supina senza alcuna spiegazione sull'andamento del test. L'ECG verrà registrato al basale e permanentemente durante il test. La MST verrà quindi eseguita bruscamente in base al livello di istruzione del paziente (aritmetica mentale, geografia o nomi di personaggi Disney per bambini) con l'esigenza di risposte corrette e rapide. La MST sarà considerata rilevante in presenza di un aumento della frequenza cardiaca di almeno 20 battiti al minuto. In caso di assenza di aumento di 20 battiti al minuto della frequenza cardiaca, il test sarà considerato non interpretabile a meno che non venga identificato un prolungamento significativo del QTc. MST di solito dura meno di 2 minuti. Un nuovo ECG verrà registrato 30 minuti dopo la fine del test nel tentativo di ottenere un tracciato ECG con la frequenza cardiaca più bassa.

Diagnosi

L'ECG eseguito al basale, durante lo stress test e durante il test farmacologico sarà rivisto da due medici all'oscuro dello stato clinico e genetico. Tutti i dati saranno raccolti in un core database.

I criteri di diagnosi hanno aderito alle linee guida dell'ultima Consensus Conference24,26. Gli investigatori considereranno inoltre un delta QTm> 30 ms durante l'adrenalina o il test di stress mentale e un delta QTc> 30 ms a 3 minuti dopo lo stress test, come sufficiente per la diagnosi di LQTS 27,28.

Sarà osservato un intervallo minimo di 30 minuti tra ogni test per consentire la clearance delle catecolamine. Tutti i test verranno eseguiti almeno 5 giorni dopo l'interruzione di ogni trattamento che potrebbe interferire con i test.

Questo studio è condotto secondo le linee guida europee per la ricerca clinica e genetica. L'approvazione del protocollo sarà ottenuta dai comitati etici istituzionali. Il consenso informato scritto sarà ottenuto da ciascun paziente che ha accettato di partecipare allo studio clinico e genetico.

Analisi statistica Le analisi statistiche saranno effettuate con il software Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York). Le variabili categoriali saranno presentate con i loro numeri e percentuali. Il test esatto del chi-quadro o di Fisher (basato sulla frequenza prevista) verrà utilizzato per confrontare le variabili categoriali tra i gruppi.

Le variabili quantitative saranno presentate come media ± deviazione standard o mediana (25°; 75°). L'analisi delle variabili continue sarà eseguita utilizzando un t-test o un test di Mann Whitney basato sulla distribuzione. I confronti tra le famiglie saranno eseguiti utilizzando il valore medio intra-familiare o la mediana della variabile continua al fine di limitare la distorsione verso la dimensione della famiglia. Un valore P a due code inferiore a 0,05 sarà considerato per indicare significatività statistica in tutti i test.

Compito 2: identificare il ruolo dello stress mentale nel prolungamento dell'intervallo QT

Per identificare il ruolo dello stress mentale nel prolungamento dell'intervallo QT, gli investigatori registreranno inoltre gruppi di controllo positivi e negativi negli ospedali universitari di Nantes, Rennes, Tours o Brest.

Ciò consisterà nell'arruolamento di parenti consecutivi di famiglie affette da sindrome del QT lungo senza prolungamento dell'intervallo QT al basale. Il risultato di questo test sarà confrontato con lo screening convenzionale utilizzando il test da sforzo e il test dell'epinefrina. In tal modo, gli investigatori mirano ad arruolare pazienti ulteriormente definiti come portatori delle principali forme genetiche di sindrome del QT lungo (LQT1, LQT2 e LQT3, gruppo di controllo positivo).

Gli investigatori arruoleranno inoltre un gruppo di controllo negativo di pazienti sani con ECG basale normale, nessuna anomalia strutturale cardiaca e senza alcun farmaco che potrebbe interferire con l'MST. Questa popolazione sarà composta da parenti di famiglie negative per lo screening di SCD inspiegabile.

I criteri di diagnosi e il protocollo del test saranno identici a quelli definiti nell'attività 1.

Per ogni misurazione verranno utilizzati tre battiti consecutivi e verrà preso in considerazione il valore medio ottenuto dai due ricercatori. L'intervallo QT sarà misurato in DII o V5, dall'inizio del complesso QRS alla fine dell'onda T (definita come l'intersezione della tangente dell'onda T e della linea isoelettrica). L'onda U sarà esclusa dalla misurazione dell'intervallo QT.

Questo studio è condotto secondo le linee guida europee per la ricerca clinica e genetica. L'approvazione del protocollo sarà ottenuta dai comitati etici istituzionali. Il consenso informato scritto sarà ottenuto da ciascun paziente che ha accettato di partecipare allo studio clinico e genetico.

Le analisi statistiche saranno effettuate con il software Social Science® (IBM Corp., Armonk, New York). I confronti tra i gruppi saranno eseguiti per ciascun parametro clinico ed ECG al basale e durante entrambi i test (test di stress mentale, test da sforzo, test dell'epinefrina). Le variabili categoriali saranno presentate con i loro numeri e percentuali. Il test esatto del chi-quadro o di Fisher (basato sulla frequenza prevista) verrà utilizzato per confrontare le variabili categoriali tra i gruppi. Le variabili quantitative saranno presentate come media ± deviazione standard o mediana (25°; 75°). L'analisi delle variabili continue sarà eseguita utilizzando un t-test o un test di Mann Whitney basato sulla distribuzione. Un valore P a due code inferiore a 0,05 sarà considerato per indicare significatività statistica in tutti i test.

Lo sperimentatore ha già arruolato nell'ospedale di Nantes una popolazione di 30 controlli sani e 25 soggetti affetti da LQTS (LQT1=9 o LQT2=16) ma con un QTc a riposo <480 ms. I primi risultati hanno identificato una sensibilità del test da sforzo, del test dell'epinefrina e del MST rispettivamente del 60%, 95% e 94% all'interno delle famiglie, e del 76%, 93% e 92% nei controlli positivi, per una specificità del 100% raggiunta per ogni prova. Ciò conferma che il test MST può essere interessante nei pazienti con QT lungo con un'assenza di chiaro prolungamento dell'intervallo QT.

Compito 3: identificare geni specifici associati alla malattia

Obiettivo: identificare varianti rare in nuovi geni che contribuiscono fortemente al rischio di VF all'interno dei pedigree.

A Nantes sono state caratterizzate quattro grandi famiglie di fecondazione in vitro che presentavano 6 SCD (di cui 2 rianimati) e 7 episodi di sincope inspiegabili verificatisi in giovane età. Tra questi, rispettivamente 9, 10, 11 e 4 membri della famiglia mostrano un intervallo QT prolungato dopo MST e/o un altro test di provocazione mentre tutti i geni associati a LQTS erano negativi. La descrizione di questa nuova entità clinica è stata recentemente accettata per la pubblicazione sul Journal of the American College of Cardiology17. L'insorgenza di anomalie FV/SCD o ECG in individui geneticamente distanti all'interno delle famiglie rende i pedigree molto potenti per gli studi genetici, poiché maggiore è la distanza genetica, minori saranno le varianti condivise dai pazienti. Da notare che ulteriori parenti saranno esaminati clinicamente (individui con simboli di punti interrogativi sui pedigree di seguito) e potrebbero aumentare il potere dello studio genetico. Precedenti lavori di J. Barc e del gruppo di Nantes hanno dimostrato la nostra capacità di guidare progetti così ambiziosi e in particolare sulla scoperta di geni basati su un approccio familiare accoppiato al sequenziamento di nuova generazione.

compito 3.1: Genotipizzazione dell'intero genoma e analisi dei membri della famiglia affetti Obiettivo: Identificare una regione genomica condivisa dai membri affetti.

La genotipizzazione dell'intero genoma su tutti i membri della famiglia affetti sarà eseguita utilizzando la piastra Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) su Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, strumento disponibile attraverso la struttura del nucleo genomico di Nantes del nostro laboratorio. Le regioni genomiche condivise dai membri della famiglia affetti saranno valutate mediante l'analisi Identity By Descent (IBD) come descritto in precedenza. Questo passaggio è fondamentale per affinare la regione del genoma in cui si trova la variante causale. In base alla grande dimensione delle famiglie, i ricercatori possono aspettarsi che da questa analisi emergerà una regione genomica relativamente piccola. L'attenzione sarà dedicata alla potenziale regione condivisa tra le famiglie che indicherebbe un potenziale gene comune.

compito 3.2: Sequenziamento e analisi dell'intero genoma Obiettivo: identificare varianti rare tra le regioni genomiche condivise dai membri della famiglia affetti.

Qui gli investigatori eseguiranno il sequenziamento del genoma in 3 individui lontanamente imparentati affetti dalla sindrome CIQTP da ciascuno dei 4 pedigree. I vantaggi del sequenziamento del genoma risiedono nell'assenza di fasi di cattura e PCR, limitando fortemente gli artefatti di cattura, le regioni non coperte e offrendo la possibilità di scoprire una mutazione all'interno di un elemento regolatore essenziale appartenente alla regione non codificante. Il sequenziamento sarà eseguito in collaborazione con il Centro Nazionale di Genotipizzazione (CEA-CNG). La pipeline NGS segue le raccomandazioni del Broad Institute GATK "Best Practices" broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. Fondamentalmente, le letture vengono mappate utilizzando bwa-mem, i duplicati vengono rimossi utilizzando picard, GATK viene utilizzato per riallineare e ricalibrare le letture. Le varianti sono chiamate con HaplotypeCaller e sono ricalibrate con GATK. I VCF generati vengono quindi annotati con il predittore Ensembl Variant Effect. Dai file VCF e all'interno di ciascun albero genealogico, gli investigatori devono dare la priorità alle varianti condivise dai 3 individui affetti e contenute all'interno delle regioni genomiche condivise (IBD). Dalle varianti condivise gli investigatori si concentreranno su varianti rare e quindi filtreranno le varianti comuni nella popolazione generale (frequenza allelica minore> 0,1%). Per questo gli investigatori utilizzeranno database di esomi/genomi pubblici e interni che raccolgono in totale circa 130.000 esomi e 20.000 genomi come il consorzio gnomaAD, 1000Genomes, il genoma dei Paesi Bassi e controlli abbinati demografici specificamente dall'area di Nantes (studio PREGO -www.vacarme-project.org). Ciò dovrebbe tradursi in un breve elenco di poche varianti/geni "candidati" per famiglia. Una previsione bioinformatica del loro effetto funzionale sarà valutata dai programmi SIFT e Polyphen2 per evidenziare presunte varianti maligne tra queste. Gli investigatori convalideranno tutte le varianti identificate in tal modo dal sequenziamento di Sanger e indagheranno sulla loro co-segregazione con altri membri della famiglia affetti nei rispettivi pedigree. L'esperienza della struttura centrale di genomica e bioinformatica di Nantes del nostro laboratorio, che sono riconosciute come infrastrutture nazionali francesi in genomica (IBiSA) e bioinformatica (Institut Français de Bioinformatique), unita alla nostra esperienza nella gestione dei dati NGS assicurerà la fattibilità di questo Task. Inoltre, nel nostro gruppo è in corso un ampio progetto di sequenziamento del genoma che raccoglie più di 1000 interi genomi (inclusi pazienti cardiopatici e individui della popolazione generale). L'esperienza di questo progetto rafforzerà l'efficienza dell'analisi del compito n. 3 e le possibilità di successo.

Attività 4: eseguire la profilazione trascrittomica ed elettrofisiologica di cardiomiociti derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti con CIQTP per identificare biomarcatori putativi e meccanismi fisiopatologici

I ricercatori ipotizzano che i cardiomiociti pluripotenti derivati ​​​​da cellule staminali (iPSC-CM) generati da pazienti CIQPT ci consentiranno di identificare i cambiamenti di espressione genica globale e le alterazioni elettrofisiologiche associate alla malattia. Per questo, gli investigatori mirano a confrontare iPSC-CM generati da membri delle 4 famiglie descritte nell'attività 3. All'interno di ogni pedigree gli investigatori selezioneranno un soggetto sano "di controllo" (che non presenta il prolungamento del QT familiare) e 2 pazienti CIPQT.

Le linee cellulari iPS di controllo LQT positivo e di controllo sano negativo sono già state generate e studiate a Nantes nel contesto di un precedente studio su LQT2 che dimostra la fattibilità di questo compito. Ciò offrirà anche l'opportunità di confrontare la firma trascrittomica ed elettrofisiologica di CIPQT con quella di LTQ2. Per ogni linea sono stati validati 3 cloni di cellule iPS: tutte le linee hanno cariotipo normale e soddisfano gli attuali standard di pluripotenza. I ricercatori hanno differenziato con successo le cellule iPS nel lignaggio cardiaco, utilizzando un metodo recentemente descritto basato sulla modulazione temporale della segnalazione Wnt/ß-catenina utilizzando piccole molecole. I dati preliminari suggeriscono che i ricercatori possono generare un'elevata purezza ed efficienza della differenziazione cardiaca. Per quanto riguarda le cellule iPS del paziente LQT2, i ricercatori hanno dimostrato che la mutazione hERG A561P porta a un difetto di traffico che si traduce in una riduzione della corrente IKr e, di conseguenza, nel prolungamento del potenziale d'azione e nelle aritmie cellulari (precoci dopo depolarizzazioni).

Dopo l'ottenimento e la validazione di tutte le linee cellulari iPS, il primo passo del progetto consisterà nell'identificazione del profilo di espressione genica cardiaca associato a CIQTP. Per questo, i ricercatori utilizzeranno cardiomiociti differenziati dal controllo e cellule iPS derivate dal paziente (giorno 28) per eseguire analisi di sequenziamento dell'RNA, in collaborazione con la struttura principale di Genomics del nostro laboratorio. Gli investigatori eseguiranno anche analisi del potenziale d'azione ad alto rendimento e della corrente ionica utilizzando tecniche automatiche di patch clamp e ottiche (CellOptiq®) in condizioni basali e dopo stimolazione adrenergica indotta da farmaci. Tutte combinate, queste analisi ci forniranno la prima identificazione del profilo elettrofisiologico associato a CIQTP nei cardiomiociti umani. Con questa analisi, i ricercatori saranno in grado di collegare il programma di espressione genica alterata associato a CIQTP alla fisiologia cardiaca difettosa.

Protocolli di differenziamento cardiaco iPSC: le cellule saranno coltivate su una piastra rivestita di Matrigel ed esposte a citochine cardiogeniche: CHIR e IWR-1. Le colonie battenti compaiono dopo circa 10 giorni. Dopo 20 giorni, le cellule saranno dissociate e riseminate per analisi elettrofisiologiche, 10 giorni dopo. Infine, dopo 28 giorni di differenziamento, le cellule battenti saranno raccolte per l'analisi dell'RNA seq.

Sequenziamento dell'intero trascrittoma (RNAseq): verranno raccolte le cellule iPSC-CM battenti a 28 giorni di 3 differenziazione da 2 cloni di ciascuna linea cellulare iPS e l'RNA verrà estratto utilizzando il kit Macherey-Nagel. La presenza e la quantità di ciascun RNA dei campioni saranno quindi valutate utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (tecnologia Illumina HiSeq). L'analisi bioinformatica sarà eseguita dalla core facility BIRD del nostro laboratorio.

Registrazioni della corrente ionica mediante patch clamp automatizzato: i difetti di ripolarizzazione di CIQTP probabilmente riflettono la disfunzione di specifiche correnti ioniche che verranno registrate utilizzando patch-clamp a cellule intere: corrente di sodio, INa, corrente di calcio, ICa, L e correnti di potassio, IKs e IKr.

Registrazione del potenziale d'azione: questa registrazione verrà eseguita utilizzando 2 tecniche.

1. Le cellule battenti isolate saranno analizzate utilizzando la tecnica del patch-clamp perforato con amfotericina B a 37°C. Le patch pipette saranno riempite con una soluzione che ha una composizione ionica simile al fluido intracellulare.
2. Le registrazioni ottiche del potenziale d'azione saranno eseguite su cardiomiociti dopo 28 giorni di differenziamento, con 5 µmol/L di-8-ANEPPS come colorante voltaggio sensibile utilizzando la tecnologia CellOptiq® (Clyde Biosciences). Le cellule saranno incubate a 37°C, 5% CO2 e 20% O2 durante le 2 ore di incubazione del colorante e durante la registrazione.