CIQTP-verlenging: rol en mechanisme bij plotselinge hartdood (IQARE-SCD)

Plotselinge hartdood (SCD) is een belangrijke doodsoorzaak in ontwikkelde landen. In Frankrijk sterven jaarlijks naar schatting 40.000 tot 50.000 personen plotseling. Bij de meeste van deze sterfgevallen zijn ouderen betrokken en zijn ze gerelateerd aan coronaire hartziekte. In Frankrijk sterven echter jaarlijks naar schatting 4000 tot 5000 personen tussen 1 en 45 jaar plotseling. SCD komt vaak voor bij jonge slachtoffers zonder herkenbare ECG-afwijkingen en zonder structurele defecten. Bijgevolg blijven de meeste SCD-gebeurtenissen bij de jongvolwassene onverklaard en worden ze geclassificeerd in een ongrijpbare groep die bekend staat als idiopathische ventrikelfibrillatie (IVF).

Onderzoeker heeft onlangs een nieuwe aritmische entiteit geïdentificeerd (door catecholamine geïnduceerde QT-verlenging; CIQTP) die verantwoordelijk is voor SCD en wordt gekenmerkt door een normale QT-duur in rust maar een grote QT-verlenging tijdens mentale stresstest. Het doel van dit translationele project is om de prevalentie van dit nieuwe fenotype van zeldzame ziekte bij onverklaarde SCD te bepalen en het onderliggende pathofysiologische mechanisme te identificeren.

Het gebruik van een mentale stresstest kan worden uitgebreid naar andere erfelijke aritmische aandoeningen, zoals het lange-QT-syndroom. Gezien het potentieel om nieuwe getroffen familieleden te identificeren, kan dit leiden tot een aanzienlijke vermindering van het risico op herhaling van plotselinge hartdood in een familie.

Het belangrijkste probleem van dit project is het beschrijven van de klinische implicatie en het pathofysiologische mechanisme van dit nieuwe syndroom dat leidt tot plotselinge hartdood.

Op basis van onze recente beschrijving van deze door cathecholamine geïnduceerde QT-verlenging, veronderstellen de onderzoekers dat:

• Dit syndroom is mede betrokken bij de 60% van niet-gediagnosticeerde familiale IVF na volledige familiale screening7. Aangezien het basislijn-ECG normaal is zonder MST, kan identificatie van dergelijke klinische kenmerken inderdaad worden uitgevoerd door middel van een mentale stresstest bij proband en familieleden die voorheen werden beschouwd als niet beïnvloed door erfelijke aritmische ziekte.
• Mentale stresstest zal helpen bij het identificeren van borderline-gevallen van andere erfelijke aritmie, zoals het lange-QT-syndroom. Deze erfelijke aritmie wordt inderdaad gekenmerkt door een genetisch gebaseerde verlenging van het QT-interval waargenomen op het baseline-ECG, hoewel meer dan een derde van de patiënten zich presenteert met slechts een lichte QT-verlenging bij baseline. Bijgevolg vereisen ze het gebruik van provocatietesten (bijv. inspanningstest en adrenalinetest) om pathologische QT-verlenging te ontmaskeren18. De onderzoeker veronderstelt dat MST kan helpen om deze QT-verlenging te ontmaskeren.
• Op basis van de autosomale overervingswijze die de onderzoeker onlangs voor deze ziekte heeft beschreven, veronderstelt de onderzoeker dat dit syndroom tot de mendeliaanse stoornissen behoort. Daarom stellen de onderzoekers voor om een ​​familiale benadering toe te passen om de belangrijkste genen te identificeren die geassocieerd zijn met het CIQTP-syndroom.

De reikwijdte van dit project is het beschrijven van de klinische implicatie en het pathofysiologische mechanisme van dit nieuwe syndroom dat leidt tot plotselinge hartdood. Meer specifiek hebben de onderzoekers tot doel:

• bepaal de prevalentie van CIQTP bij onverklaarde SCD en identificeer nieuwe grote getroffen families
• identificeer de rol van mentale stress bij QT-verlenging
• identificeren van geassocieerde genen met de ziekte door sequentiebepaling van het hele genoom en Identity By Descent-analyse in grote families te combineren
• transcriptomische en elektrofysiologische profilering uitvoeren van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) van CIQTP-patiënten om vermeende biomarkers en pathofysiologische mechanismen te identificeren.

Op basis van deze translationele benadering trachten de onderzoekers de pathofysiologie en de klinische implicatie van CIQTP bij plotselinge hartdood te beschrijven. De beschrijving van dit nieuwe syndroom met behulp van een innovatieve benadering, zoals sequentiebepaling van het hele genoom en iPSC-CM-profilering, kan een uitgebreide en grote vooruitgang opleveren op het gebied van onverklaarde SCD. Naast de identificatie en de zorg van nieuw getroffen familieleden, kan het helpen bij het definiëren van een op genetische/pathofysiologie gebaseerde therapie.

De onderzoekers hebben al bewezen dat MST een zeer efficiënt diagnostisch hulpmiddel is om dit nieuwe syndroom op te sporen, en de onderzoekers geloven dat het ook kan helpen om QT-verlenging in stille LQTS-mutatiedragers te ontmaskeren. MST heeft als voordeel dat het snel en eenvoudig toepasbaar is. Het zou dus van groot belang kunnen zijn om familiale segregatie te ontdekken voor onverklaarbare cardiale elektrische defecten die autosomaal dominante transmissie vertonen. Het zou bovendien de schijnbare niet-penetrantie kunnen verminderen die wordt aangetroffen in LQTS.

Taken van het project

Taak 1: bepaal de prevalentie van CIQTP bij onverklaarde SCD en identificeer nieuwe getroffen families

De meeste gevallen van plotselinge hartdood vóór de leeftijd van 45 jaar blijven onverklaard en zijn waarschijnlijk te wijten aan erfelijke aritmie6. Na onverklaarbare SCZ zullen alle opeenvolgende families die verwezen zijn naar de Universitaire Ziekenhuizen van Nantes, Rennes, Tours of Brest in de studie worden opgenomen.

Alle beschikbare klinische proband-gegevens zullen worden verzameld bij de verwijzende artsen en familieleden. Wanneer autopsie wordt uitgevoerd, zullen de probands van wie de diagnose haalbaar is, worden uitgesloten van de studie.

Familiale screening Na onverklaarbare SCZ vóór de leeftijd van 45 jaar, zal familiale screening worden uitgevoerd bij eerstegraads familieleden en vervolgens worden uitgebreid naar andere familieleden indien positief. Wanneer eerstegraadsverwanten niet beschikbaar zijn voor screening, wordt deze uitgevoerd bij verder weg gelegen verwanten.

Klinische screening omvat een beoordeling van de medische geschiedenis in het verleden, klinisch onderzoek en baseline ECG. Bij uitblijven van een diagnose na deze eerste reeks onderzoeken, stresstest, transthoracaal echocardiogram (TTE), natriumkanaalblokkerende provocatie (SCBC) ofwel met ajmaline (1 mg/kg) of flecaïnide (2 mg/kg) en een epinefrinetest23, 24 worden uitgevoerd. Er zal ook een mentale stresstest worden uitgevoerd om QT-verlenging te ontmaskeren met een normaal basislijn-ECG 25.

Protocol mentale stresstest (bijlage 2) MST wordt als volgt uitgevoerd. Patiënten worden in rugligging geplaatst zonder uitleg over het verloop van de test. ECG wordt opgenomen bij baseline en permanent tijdens de test. MST wordt dan abrupt uitgevoerd volgens het opleidingsniveau van de patiënt (hoofdrekenen, aardrijkskunde of namen van Disney-personages voor kinderen) met een vereiste voor correcte en snelle antwoorden. MST wordt als relevant beschouwd bij een toename van de hartslag met ten minste 20 slagen per minuut. Als er geen verhoging van de hartslag met 20 slagen per minuut optreedt, wordt de test als niet-interpreteerbaar beschouwd, tenzij een significante verlenging van de QTc wordt vastgesteld. MST duurt meestal minder dan 2 minuten. Een nieuw ECG wordt 30 minuten na het einde van de test opgenomen in een poging een ECG-trace met de laagste hartslag te verkrijgen.

Diagnose

ECG uitgevoerd bij baseline, tijdens de stresstest en tijdens de farmacologische test zal worden beoordeeld door twee artsen die blind zijn voor de klinische en genetische status. Alle gegevens worden verzameld in een kerndatabase.

De diagnosecriteria voldeden aan de richtlijnen van de laatste consensusconferentie24,26. De onderzoekers zullen bovendien een delta QTm > 30 ms tijdens epinefrine of de mentale stresstest en een delta QTc > 30 ms 3 min na de stresstest als voldoende beschouwen voor de diagnose van LQTS 27,28.

Er wordt een minimuminterval van 30 minuten tussen elke test in acht genomen om catecholamineklaring mogelijk te maken. Alle tests worden uitgevoerd ten minste 5 dagen na het onderbreken van elke behandeling die de tests zou kunnen verstoren.

Deze studie wordt uitgevoerd volgens de Europese richtlijnen voor klinisch en genetisch onderzoek. Protocolgoedkeuring zal worden verkregen van institutionele ethische commissies. Geïnformeerde schriftelijke toestemming zal worden verkregen van elke patiënt die ermee heeft ingestemd deel te nemen aan de klinische en genetische studie.

Statistische analyse Statistische analyses worden uitgevoerd met Social Science® software (IBM Corp., Armonk, New York). Categorische variabelen worden gepresenteerd met hun aantallen en percentages. De chikwadraat- of Fisher exact-test (gebaseerd op verwachte frequentie) wordt gebruikt om categorische variabelen tussen groepen te vergelijken.

Kwantitatieve variabelen worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie of mediaan (25e; 75e). Analyse van continue variabelen zal worden uitgevoerd met behulp van een t-toets of Mann Whitney-toets op basis van verdeling. Vergelijkingen tussen gezinnen zullen worden uitgevoerd met behulp van intrafamiliale gemiddelde waarde of mediaan van continue variabele om de voorkeur voor gezinsgrootte te beperken. Een tweezijdige P-waarde van minder dan 0,05 wordt in alle tests als statistisch significant beschouwd.

Taak 2: identificeer de rol van mentale stress bij QT-verlenging

Om de rol van mentale stress bij QT-verlenging te identificeren, zullen de onderzoekers bovendien positieve en negatieve controlegroepen inschrijven in de universitaire ziekenhuizen van Nantes, Rennes, Tours of Brest.

Dit zal bestaan ​​uit de inschrijving van opeenvolgende familieleden van families die getroffen zijn door het lange-QT-syndroom zonder QT-verlenging bij baseline. Het resultaat van deze test zal worden vergeleken met conventionele screening met behulp van een inspanningstest en een epinefrinetest. Daarbij streven de onderzoekers ernaar patiënten te rekruteren die verder worden gedefinieerd als dragers van de belangrijkste op genen gebaseerde vormen van het lange-QT-syndroom (LQT1, LQT2 en LQT3, positieve controlegroep).

De onderzoekers zullen bovendien een negatieve controlegroep inschrijven van gezonde patiënten met een normaal basislijn-ECG, geen structurele cardiale afwijkingen en zonder enige medicatie die de MST zou kunnen verstoren. Deze populatie zal bestaan ​​uit familieleden van families die negatief zijn voor screening op onverklaarde SCD.

De diagnosecriteria en het testprotocol zijn identiek aan die gedefinieerd in taak 1.

Voor elke meting worden drie opeenvolgende slagen gebruikt en er wordt rekening gehouden met de gemiddelde waarde verkregen door de twee onderzoekers. Het QT-interval wordt gemeten in DII of V5, vanaf het begin van het QRS-complex tot het einde van de T-golf (gedefinieerd als het snijpunt van de raaklijn van de T-golf en de iso-elektrische lijn). U-wave wordt uitgesloten van de meting van het QT-interval.

Deze studie wordt uitgevoerd volgens de Europese richtlijnen voor klinisch en genetisch onderzoek. Protocolgoedkeuring zal worden verkregen van institutionele ethische commissies. Geïnformeerde schriftelijke toestemming zal worden verkregen van elke patiënt die ermee heeft ingestemd deel te nemen aan de klinische en genetische studie.

Statistische analyses zullen worden uitgevoerd met Social Science® software (IBM Corp., Armonk, New York). Vergelijkingen tussen groepen zullen worden uitgevoerd voor elke klinische en ECG-parameter bij aanvang en tijdens beide tests (mentale stresstest, inspanningstest, epinefrinetest). Categorische variabelen worden gepresenteerd met hun aantallen en percentages. De chikwadraat- of Fisher exact-test (gebaseerd op verwachte frequentie) wordt gebruikt om categorische variabelen tussen groepen te vergelijken. Kwantitatieve variabelen worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie of mediaan (25e; 75e). Analyse van continue variabelen zal worden uitgevoerd met behulp van een t-toets of Mann Whitney-toets op basis van verdeling. Een tweezijdige P-waarde van minder dan 0,05 wordt in alle tests als statistisch significant beschouwd.

De onderzoeker heeft in het ziekenhuis van Nantes al een populatie van 30 gezonde controles en 25 proefpersonen met LQTS (LQT1=9 of LQT2=16) maar met een QTc in rust <480 ms ingeschreven. De eerste resultaten hebben een sensitiviteit van de inspanningstest, epinefrinetest en MST geïdentificeerd van respectievelijk 60%, 95% en 94% binnen de families, en 76%, 93% en 92% binnen de positieve controles, voor een specificiteit van 100% bereikt voor elke toets. Dit bevestigt dat de MST-test interessant kan zijn bij lange QT-patiënten zonder duidelijke QT-verlenging.

Taak 3: identificeer specifieke genen die geassocieerd zijn met de ziekte

Doelstelling: het identificeren van zeldzame varianten in nieuwe genen die sterk bijdragen aan het risico op VF binnen stambomen.

Vier grote IVF-families met 6 SCZ (waarvan 2 gereanimeerd) en 7 onverklaarbare syncope-episodes die op jonge leeftijd optraden, zijn gekarakteriseerd in Nantes. Onder hen vertoonden respectievelijk 9, 10, 11 en 4 familieleden een verlengd QT-interval na MST en/of een andere provocatieve test terwijl alle LQTS-geassocieerde genen negatief waren. De beschrijving van deze nieuwe klinische entiteit is onlangs geaccepteerd voor publicatie in het Journal of the American College of Cardiology17. Het optreden van VF/SCD- of ECG-afwijkingen bij genetisch ver verwijderde individuen binnen families maakt stambomen zeer krachtig voor genetische studies, aangezien hoe groter de genetische afstand, hoe minder varianten de patiënten zullen delen. Merk op dat aanvullende familieleden klinisch worden onderzocht (individu met vraagtekensymbolen op stambomen hieronder) en kunnen de kracht van het genetische onderzoek vergroten. Eerdere werken van J. Barc en de Nantes-groep toonden ons vermogen om zulke ambitieuze projecten te leiden, en specifiek op het gebied van genontdekking op basis van familiale benadering gekoppeld aan sequencing van de volgende generatie.

taak3.1: Genotypering van het hele genoom en analyse van de getroffen familieleden Doel: Identificeer een genoomgebied dat wordt gedeeld door de getroffen leden.

Genoombrede genotypering op alle getroffen familieleden zal worden uitgevoerd met behulp van Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) Plate op Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, instrument beschikbaar via de genomische kernfaciliteit van Nantes van ons laboratorium. Genomische regio's die worden gedeeld door getroffen familieleden zullen worden beoordeeld door middel van Identity By Descent (IBD)-analyse, zoals eerder beschreven. Deze stap is cruciaal om het genoomgebied te verfijnen waar de causale variant zich bevindt. Gezien de grote omvang van de families kunnen de onderzoekers verwachten dat uit deze analyse een relatief klein genoomgebied naar voren zal komen. Er zal aandacht worden besteed aan mogelijk gedeelde regio's tussen families die zouden kunnen duiden op een potentieel gemeenschappelijk gen.

taak3.2: Sequentie en analyse van het hele genoom Doel: zeldzame varianten identificeren tussen de genomische regio's die worden gedeeld door getroffen familieleden.

Hier zullen de onderzoekers genoomsequencing uitvoeren bij 3 ver verwante individuen die getroffen zijn door het CIQTP-syndroom uit elk van de 4 stambomen. Voordelen van genoomsequencing liggen in de afwezigheid van capture- en PCR-stappen, waardoor de capture-artefacten, de niet-bedekte regio's sterk worden beperkt en de mogelijkheid wordt geboden om een ​​mutatie te ontdekken binnen een essentieel regulerend element dat behoort tot de niet-coderende regio. Sequencing zal worden uitgevoerd in samenwerking met het National Genotyping Centre (CEA-CNG). De NGS-pijplijn volgt de aanbevelingen van het Broad Institute GATK "Best Practices" broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. Kortom, reads worden in kaart gebracht met behulp van bwa-mem, duplicaten worden verwijderd met behulp van picard, GATK wordt gebruikt om de reads opnieuw uit te lijnen en opnieuw te kalibreren. De varianten worden aangeroepen met HaplotypeCaller en opnieuw gekalibreerd met GATK. De gegenereerde VCF's worden vervolgens geannoteerd met de Ensembl Variant Effect-voorspeller. Vanuit VCF-bestanden en binnen elke stamboom zullen de onderzoekers prioriteit geven aan varianten die worden gedeeld door de 3 getroffen individuen en die zijn opgenomen in gedeelde genomische regio's (IBD). Van de gedeelde varianten zullen de onderzoekers zich concentreren op zeldzame varianten en vervolgens varianten uitfilteren die algemeen voorkomen in de algemene populatie (kleine allelfrequentie >0,1%). Hiervoor zullen de onderzoekers openbare en interne exome/genoom-databases gebruiken die in totaal ongeveer 130.000 exomen en 20.000 genomen verzamelen, zoals het gnomAD-consortium, 1000Genomes, het genoom van Nederland en demografische gematchte controles specifiek uit de regio Nantes (PREGO-studie -www.vacarme-project.org). Dit zal naar verwachting resulteren in een shortlist van weinig "kandidaat" varianten/genen per familie. Een bio-informatica-voorspelling van hun functionele effect zal worden beoordeeld door de programma's SIFT en Polyphen2 om vermoedelijke kwaadaardige varianten daarvan te benadrukken. De onderzoekers zullen alle varianten valideren die op een dergelijke manier zijn geïdentificeerd door Sanger-sequencing en hun co-segregatie met andere getroffen familieleden in de respectievelijke stambomen onderzoeken. Ervaring met de genomica- en bioinformatica-kernfaciliteit van Nantes van ons laboratorium, die wordt erkend als Franse nationale infrastructuur voor genomica (IBiSA) en bio-informatica (Institut Français de Bioinformatique), gekoppeld aan onze ervaring in NGS-gegevensbeheer, zal de haalbaarheid van deze taak verzekeren. Verder loopt er in onze groep een groot genoomsequencingproject dat meer dan 1000 volledige genen verzamelt (inclusief hartpatiënten en individuen uit de algemene bevolking). De ervaring met dit project zal de efficiëntie van de analyse van taak#3 en de kans op succes versterken.

Taak 4: voer transcriptomische en elektrofysiologische profilering uit van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten van CIQTP-patiënten om vermeende biomarkers en pathofysiologische mechanismen te identificeren

De onderzoekers stellen de hypothese dat geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM's) gegenereerd door CIQPT-patiënten ons in staat zullen stellen de globale genexpressieveranderingen en elektrofysiologische veranderingen geassocieerd met de ziekte te identificeren. Daartoe streven de onderzoekers naar het vergelijken van iPSC-CM's die zijn gegenereerd door leden van de 4 families beschreven in taak 3. Binnen elke stamboom zullen de onderzoekers één "controle" gezonde proefpersoon selecteren (niet met de familiale QT-verlenging) en 2 CIPQT-patiënten.

Positieve LQT-controle en negatieve gezonde controle iPS-cellijnen zijn al gegenereerd en bestudeerd in Nantes in de context van een eerdere studie over LQT2 die de haalbaarheid van deze taak aantoonde. Dit biedt ook de mogelijkheid om de transcriptomische en elektrofysiologische signatuur van CIPQT te vergelijken met die van LTQ2. Voor elke lijn zijn 3 iPS-celklonen gevalideerd: alle lijnen hebben een normaal karyotype en voldoen aan de huidige normen voor pluripotentie. De onderzoekers hebben met succes de iPS-cellen gedifferentieerd in de hartlijn, met behulp van een recent beschreven methode gebaseerd op temporele modulatie van Wnt/ß-catenine-signalering met behulp van kleine moleculen. Voorlopige gegevens suggereren dat de onderzoekers een hoge zuiverheid en efficiëntie van cardiale differentiatie kunnen genereren. Met betrekking tot de iPS-cellen van de LQT2-patiënt toonden de onderzoekers aan dat de hERG A561P-mutatie leidt tot een handelsdefect dat resulteert in een verminderde IKr-stroom, en dientengevolge tot verlenging van de actiepotentiaal en cellulaire aritmieën (vroege afterdepolarisaties).

Na het verkrijgen en valideren van alle iPS-cellijnen, zal de eerste stap van het project bestaan ​​uit de identificatie van het cardiale genexpressieprofiel geassocieerd met CIQTP. Daarvoor zullen de onderzoekers cardiomyocyten gebruiken die zijn gedifferentieerd van controle- en patiënt-afgeleide iPS-cellen (dag 28) om RNA seq-analyses uit te voeren, in samenwerking met de Genomics-kernfaciliteit van ons laboratorium. De onderzoekers zullen ook high-throughput actiepotentiaal- en ionische stroomanalyses uitvoeren met behulp van geautomatiseerde patch-clamp- en optische technieken (CellOptiq®) onder basiscondities en na door geneesmiddelen geïnduceerde adrenerge stimulatie. Alles bij elkaar zullen deze analyses ons de eerste identificatie opleveren van het elektrofysiologische profiel geassocieerd met CIQTP in menselijke cardiomyocyten. Met deze analyse kunnen de onderzoekers het CIQTP-geassocieerde veranderde genexpressieprogramma koppelen aan defecte cardiale fysiologie.

iPSC cardiale differentiatieprotocollen: cellen worden gekweekt op een Matrigel-gecoate plaat en blootgesteld aan cardiogene cytokines: CHIR en IWR-1. Klopkolonies verschijnen na ongeveer 10 dagen. Na 20 dagen worden de cellen gescheiden en 10 dagen later opnieuw gezaaid voor elektrofysiologische analyses. Ten slotte zullen na 28 dagen differentiatie kloppende cellen worden verzameld voor RNA seq-analyse.

Whole transcriptome sequencing (RNAseq): het verslaan van iPSC-CM's op 28 dagen van 3 differentiatie van 2 klonen van elke iPS-cellijn zal worden verzameld en RNA zal worden geëxtraheerd met behulp van de Macherey-Nagel-kit. Aanwezigheid en hoeveelheid van elk RNA van de monsters zal vervolgens worden beoordeeld met behulp van sequencing van de volgende generatie (Illumina HiSeq-technologie). Bio-informatica-analyse zal worden uitgevoerd door de BIRD-kernfaciliteit van ons laboratorium.

Ionische stroomopnamen door geautomatiseerde patch-clamp: de repolarisatiedefecten van CIQTP weerspiegelen waarschijnlijk disfunctie van specifieke ionische stromen die zullen worden opgenomen met behulp van patch-clamp voor hele cellen: natriumstroom, INa, calciumstroom, ICa, L en kaliumstromen, IK's en IKr.

Actiepotentiaalopname: Deze opname wordt uitgevoerd met behulp van 2 technieken.

1. Geïsoleerde kloppende cellen zullen worden geanalyseerd met behulp van geperforeerde patch-clamp-techniek met amfotericine B bij 37oC. Patchpipetten worden gevuld met een oplossing met een ionische samenstelling die vergelijkbaar is met de intracellulaire vloeistof.
2. Actiepotentiaal optische opnames zullen worden uitgevoerd op cardiomyocyten na 28 dagen differentiatie, met 5 µmol/L di-8-ANEPPS als spanningsgevoelige kleurstof met behulp van de CellOptiq®-technologie (Clyde Biosciences). Cellen worden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 20% O2 tijdens de 2 uur durende incubatie van de kleurstof en tijdens de opname.