CIQTP-forlængelse: Rolle og mekanisme ved pludselig hjertedød (IQARE-SCD)

Pludselig hjertedød (SCD) er en væsentlig dødsårsag i udviklede lande. Det anslås, at 40.000 til 50.000 individer dør pludseligt hvert år i Frankrig. De fleste af disse dødsfald involverer ældre mennesker og er relateret til koronararteriesygdom. Imidlertid dør anslået 4000 til 5000 individer mellem 1 og 45 år pludseligt hvert år i Frankrig. SCD forekommer ofte hos unge ofre uden identificerbare EKG-abnormiteter og uden strukturelle defekter. Som følge heraf forbliver de fleste SCD-hændelser hos den unge voksne uforklarlige og klassificeres i en undvigende gruppe kendt som idiopatisk ventrikulær fibrillation (IVF).

Efterforsker har for nylig identificeret en ny arytmisk enhed (katekolamin-induceret QT-forlængelse; CIQTP) ansvarlig for SCD og karakteriseret ved normal QT-varighed i hvile, men større QT-forlængelse under mental stresstest. Målet med dette translationelle projekt er at bestemme prævalensen af ​​denne nye fænotype af sjælden sygdom i uforklaret SCD og identificere dens underliggende patofysiologiske mekanisme.

Brugen af ​​mental stresstest kan udvides til andre arvelige arytmiske sygdomme såsom lang QT-syndrom. I betragtning af potentialet for identifikation af nye berørte slægtninge kan det føre til en betydelig reduktion af risikoen for pludseligt tilbagefald af hjertedød i en familie.

Hovedspørgsmålet i dette projekt er at beskrive den kliniske implikation og den patofysiologiske mekanisme af dette nye syndrom, der fører til SCD.

Baseret på vores nylige beskrivelse af denne katekolamin-inducerede QT-forlængelse, antager efterforskerne, at:

• Dette syndrom er delvist involveret i 60 % af udiagnosticeret familiær IVF efter fuldstændig familiær screening7. Da baseline-EKG'et er normalt uden MST, kan identifikation af sådanne kliniske træk udføres ved mental stresstest hos proband og slægtninge, der tidligere blev betragtet som upåvirket af arvelig arytmisk sygdom.
• Mental stresstest vil hjælpe med at identificere grænsetilfælde af anden arvelig arytmi såsom lang QT-syndrom. Faktisk er denne arvelige arytmi karakteriseret ved en genetisk-baseret forlængelse af QT-intervallet observeret på baseline-EKG'et, dog har mere end en tredjedel af patienterne kun en let QT-forlængelse ved baseline. De kræver derfor brug af provokationstests (f.eks. træningstest og adrenalintest) for at afsløre patologisk QT-forlængelse18. Investigator antager, at MST kan hjælpe med at afsløre denne QT-forlængelse.
• Baseret på den autosomale arvelig-mode-forsker, der for nylig er beskrevet for denne sygdom, antager efterforskeren, at dette syndrom hører til de mendelske lidelser. Derfor foreslår efterforskerne at anvende en familiebaseret tilgang til at identificere de vigtigste gener forbundet med CIQTP-syndromet.

Omfanget af dette projekt er at beskrive den kliniske implikation og den patofysiologiske mekanisme af dette nye syndrom, der fører til pludselig hjertedød. Mere specifikt sigter efterforskerne på at:

• bestemme prævalensen af ​​CIQTP i uforklaret SCD og identificere nye store berørte familier
• identificere betydningen af ​​mental stress i QT-forlængelse
• identificere associerede gener med sygdommen ved at kombinere helgenomsekventering og Identity By Descent-analyse i store familier
• udføre transkriptomisk og elektrofysiologisk profilering af inducerede pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM) fra CIQTP-patienter for at identificere formodede biomarkører og patofysiologiske mekanismer.

Baseret på denne translationelle tilgang, sigter efterforskerne på at beskrive patofysiologi og klinisk implikation af CIQTP ved pludselig hjertedød. Beskrivelsen af ​​dette nye syndrom ved hjælp af innovativ tilgang såsom helgenomsekventering og iPSC-CM-profilering kan give et omfattende og stort fremskridt inden for uforklaret SCD. Ud over identifikation og pleje af nyligt ramte slægtninge, kan det hjælpe med at definere en genetisk/patofysiologisk baseret terapi.

Efterforskerne har allerede bevist, at MST er et meget effektivt diagnostisk værktøj til at opdage dette nye syndrom, og efterforskerne mener, at det også kan hjælpe med at afsløre QT-forlængelse hos tavse LQTS-mutationsbærere. MST har fordelen ved at være hurtig og enkel at anvende. Det kunne derfor være af stor interesse at afdække familiær segregation for uforklarlige elektriske hjertefejl, der viser autosomal dominant transmission. Det kan desuden mindske den tilsyneladende ikke-penetrance, der forekommer i LQTS.

Projektets opgaver

Opgave 1: Bestem prævalensen af ​​CIQTP i uforklaret SCD og identificer nye berørte familier

De fleste tilfælde af SCD før 45-årsalderen forbliver uforklarlige og skyldes sandsynligvis en arvelig arytmisk sygdom6. Efter uforklaret SCD vil alle på hinanden følgende familier, der henvises til Nantes, Rennes, Tours eller Brest Universitetshospitaler, blive inkluderet i undersøgelsen.

Alle tilgængelige kliniske probanddata vil blive indsamlet fra de henvisende læger og pårørende. Når obduktion udføres, vil de probander, hvis diagnose kan opnås, blive udelukket fra undersøgelsen.

Familiescreening Efter uforklaret SCD før det fyldte 45. år vil familiær screening blive udført hos førstegradsslægtninge og derefter udvidet til andre pårørende, hvis de er positive. Når 1. grads pårørende ikke er tilgængelige for screening, vil det blive udført i fjernere pårørende.

Klinisk screening vil omfatte en gennemgang af tidligere sygehistorie, klinisk undersøgelse og baseline EKG. I mangel af diagnose efter dette første sæt af undersøgelser, stresstest, transthorax ekkokardiogram (TTE), natriumkanalblokkerudfordring (SCBC) enten med ajmalin (1 mg/kg) eller flecainid (2 mg/kg) og en epinephrintest23, 24 vil blive opført. Mental stresstest vil desuden blive udført for at afsløre QT-forlængelse med normal baseline EKG 25.

Protokol for mental stresstest (bilag 2) MST vil blive udført som følger. Patienterne vil blive placeret i liggende stilling uden nogen forklaring på testforløbet. EKG vil blive optaget ved baseline og permanent under testen. MST vil derefter blive udført brat i henhold til patientens uddannelsesniveau (hovedregning, geografi eller navne på Disney-figurer til børn) med et krav om korrekte og hurtige svar. MST vil blive betragtet som relevant ved tilstedeværelse af en stigning på mindst 20 slag pr. minut i hjertefrekvensen. I tilfælde af fravær af en stigning på 20 slag pr. minut i hjertefrekvensen, vil testen blive betragtet som ikke-fortolkelig, medmindre en signifikant forlængelse af QTc er identificeret. MST varer normalt mindre end 2 minutter. Et nyt EKG vil blive optaget 30 minutter efter afslutningen af ​​testen i et forsøg på at opnå en EKG-kurve med den laveste hjertefrekvens.

Diagnose

EKG udført ved baseline, under stresstesten og under den farmakologiske test vil blive gennemgået af to læger, der er blindet for den kliniske og genetiske status. Alle data vil blive samlet i en kernedatabase.

Diagnosekriterierne fulgte retningslinjerne fra den seneste konsensuskonference24,26. Efterforskerne vil desuden overveje en delta QTm > 30 ms under epinephrin eller den mentale stresstest og en delta QTc > 30 ms 3 minutter efter stresstesten, som tilstrækkeligt til diagnosticering af LQTS 27,28.

Et minimumsinterval på 30 minutter mellem hver test vil blive observeret for at muliggøre katekolamin-clearance. Alle tests vil blive udført mindst 5 dage efter afbrydelse af hver behandling, der kan interferere med testene.

Denne undersøgelse er udført i henhold til europæiske retningslinjer for klinisk og genetisk forskning. Protokolgodkendelse vil blive opnået fra institutionelle etiske udvalg. Der vil blive indhentet informeret skriftligt samtykke fra hver patient, der har accepteret at deltage i den kliniske og genetiske undersøgelse.

Statistisk analyse Statistiske analyser vil blive udført med Social Science®-software (IBM Corp., Armonk, New York). Kategoriske variabler vil blive præsenteret med deres tal og procenter. Chi-kvadrat- eller Fisher-eksakte test (baseret på forventet frekvens) vil blive brugt til at sammenligne kategoriske variabler mellem grupper.

Kvantitative variable vil blive præsenteret som middel ± standardafvigelse eller median (25.; 75.). Analyse af kontinuerte variabler vil blive udført ved hjælp af en t-test eller Mann Whitney-test baseret på fordeling. Sammenligninger mellem familier vil blive udført ved hjælp af intra-familiær middelværdi eller median af kontinuerlig variabel for at begrænse skævheden mod familiestørrelse. En tosidet P-værdi på mindre end 0,05 vil blive anset for at angive statistisk signifikans i alle test.

Opgave 2: Identificer rollen af ​​mental stress i QT-forlængelse

For at identificere rollen af ​​mental stress i QT-forlængelse vil efterforskerne desuden indskrive positive og negative kontrolgrupper på Nantes, Rennes, Tours eller Brest Universitetshospitaler.

Dette vil bestå i indskrivning af på hinanden følgende slægtninge til familier, der er ramt af langt QT-syndrom uden QT-forlængelse ved baseline. Resultatet af denne test vil blive sammenlignet med konventionel screening ved brug af træningstest og epinephrintest. Derved sigter efterforskerne på at indskrive en patient, der yderligere defineres som bærere af de vigtigste genetisk-baserede former for langt QT-syndrom (LQT1, LQT2 og LQT3, positiv kontrolgruppe).

Efterforskerne vil desuden indskrive en negativ kontrolgruppe af raske patienter med normalt baseline EKG, ingen strukturelle abnormiteter i hjertet og uden nogen form for medicin, der kunne interferere med MST. Denne population vil bestå af slægtninge til familier, der er negative for uforklarlig SCD-screening.

Diagnosekriterier og testprotokol vil være identiske med dem, der er defineret i opgave 1.

Tre på hinanden følgende slag vil blive brugt til hver måling, og den gennemsnitlige værdi opnået af de to efterforskere vil blive taget i betragtning. QT-interval vil blive målt i DII eller V5, fra begyndelsen af ​​QRS-komplekset til slutningen af ​​T-bølgen (defineret som skæringspunktet mellem tangenten af ​​T-bølgen og den isoelektriske linje). U-bølge vil blive udelukket fra målingen af ​​QT-intervallet.

Denne undersøgelse er udført i henhold til europæiske retningslinjer for klinisk og genetisk forskning. Protokolgodkendelse vil blive opnået fra institutionelle etiske udvalg. Der vil blive indhentet informeret skriftligt samtykke fra hver patient, som har accepteret at deltage i den kliniske og genetiske undersøgelse.

Statistiske analyser vil blive udført med Social Science®-software (IBM Corp., Armonk, New York). Sammenligninger mellem grupper vil blive udført for hver klinisk og EKG-parameter ved baseline og under begge tests (mental stresstest, anstrengelsestest, epinephrintest). Kategoriske variabler vil blive præsenteret med deres tal og procenter. Chi-kvadrat- eller Fisher-eksakte test (baseret på forventet frekvens) vil blive brugt til at sammenligne kategoriske variabler mellem grupper. Kvantitative variable vil blive præsenteret som middel ± standardafvigelse eller median (25.; 75.). Analyse af kontinuerte variabler vil blive udført ved hjælp af en t-test eller Mann Whitney-test baseret på fordeling. En tosidet P-værdi på mindre end 0,05 vil blive anset for at angive statistisk signifikans i alle test.

Efterforskeren har allerede indskrevet en population på 30 raske kontroller og 25 forsøgspersoner på Nantes-hospitalet, der er ramt af LQTS (LQT1=9 eller LQT2=16), men med en hvilende QTc<480 ms. De første resultater har identificeret en sensitivitet af træningstest, adrenalintest og MST på henholdsvis 60 %, 95 % og 94 % inden for familierne og 76 %, 93 % og 92 % i de positive kontroller, for en specificitet på 100 % nået for hver test. Dette bekræfter, at MST-test kan være af interesse hos patienter med lang QT uden tydelig QT-forlængelse.

Opgave 3: Identificer specifikke gener forbundet med sygdommen

Formål: At identificere sjældne varianter i nye gener, der i høj grad bidrager til risikoen for VF inden for stamtavler.

Fire store IVF-familier med 6 SCD (med 2 genoplivede) og 7 uforklarlige synkope-episoder, der forekommer i ung alder, er blevet karakteriseret i Nantes. Blandt dem viser henholdsvis 9, 10, 11 og 4 familiemedlemmer et forlænget QT-interval efter MST og/eller en anden provokerende test, mens alle LQTS-associerede gener var negative. Beskrivelsen af ​​denne nye kliniske enhed er for nylig blevet accepteret til offentliggørelse i Journal of the American College of Cardiology17. Forekomsten af ​​VF/SCD- eller EKG-abnormiteter hos genetisk fjerne individer inden for familier gør stamtavler meget effektive til genetiske undersøgelser, da jo større genetisk afstand, jo færre varianter vil patienterne dele. Det er værd at bemærke, at yderligere slægtninge vil blive undersøgt klinisk (individuelle med spørgsmålstegn symboler på stamtavler nedenfor) og kan øge kraften i genetikstudiet. Tidligere værker af J. Barc og Nantes-gruppen demonstrerede vores evne til at lede sådanne ambitiøse projekter og specifikt på genopdagelse baseret på familiær tilgang koblet til næste generations sekventering.

opgave 3.1: Genotypebestemmelse af hele genomet og analyse af de berørte familiemedlemmer Formål: Identificere en genomisk region, der deles af de berørte medlemmer.

Genomomfattende genotypebestemmelse på alle berørte familiemedlemmer vil blive udført ved hjælp af Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA)-plade på Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel, instrument tilgængeligt gennem den genomiske kernefacilitet i Nantes i vores laboratorium. Genomiske regioner, der deles af berørte familiemedlemmer, vil blive vurderet ved Identity By Descent (IBD) analyse som tidligere beskrevet. Dette trin er afgørende for at forfine genomregionen, hvor den kausale variant er placeret. Ifølge familiernes store størrelse kan efterforskerne forvente, at en relativt lille genomisk region vil komme op fra denne analyse. Opmærksomheden vil blive dedikeret til potentiel delt region blandt familier, der ville indikere et potentielt fælles gen.

opgave 3.2: Helgenomsekventering og analyse Mål: identificere sjældne varianter blandt de genomiske regioner, der deles af berørte familiemedlemmer.

Her skal efterforskerne udføre genomsekventering i 3 fjernt beslægtede individer påvirket af CIQTP syndrom fra hver af de 4 stamtavler. Fordelene ved genomsekventering ligger i fraværet af indfangnings- og PCR-trin, hvilket stærkt begrænser indfangningsartefakterne, de ikke-dækkede regioner og giver mulighed for at afdække en mutation inden for et væsentligt regulatorisk element, der tilhører den ikke-kodende region. Sekventering vil blive udført i samarbejde med National Genotyping Center (CEA-CNG). NGS-pipelinen følger anbefalingerne fra Broad Institute GATK "Best Practices" broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. Grundlæggende kortlægges læsninger ved hjælp af bwa-mem, duplikater fjernes ved hjælp af picard, GATK bruges til at justere og genkalibrere læsningerne. Varianterne kaldes med HaplotypeCaller og omkalibreres med GATK. De genererede VCF'er annoteres derefter med Ensembl Variant Effect-prædiktor. Ud fra VCF-filer og inden for hver stamtavle skal efterforskerne prioritere varianter, der deles af de 3 berørte individer og er indeholdt i delte genomiske regioner (IBD). Fra de delte varianter skal efterforskerne fokusere på sjældne varianter og derefter frafiltrere varianter, der er almindelige i den generelle befolkning (mindre allelfrekvens >0,1%). Til dette vil efterforskerne bruge offentlige og interne exom/genom-databaser, der samler i alt omkring 130.000 exomer og 20.000 genomer såsom GnomAD-konsortiet, 1000Genomes, Genomet i Holland og demografisk matchede kontroller specifikt fra Nantes-området (PREGO-undersøgelse -www.vacarme-project.org). Dette forventes at resultere i en kort liste med få "kandidat" varianter/gener pr. familie. En bioinformatisk forudsigelse af deres funktionelle effekt vil blive vurderet af programmerne SIFT og Polyphen2 for at fremhæve formodede maligne varianter blandt disse. Efterforskerne vil validere alle varianter identificeret på en sådan måde ved Sanger-sekventering og undersøge deres co-segregation med andre berørte familiemedlemmer i de respektive stamtavler. Erfaring med genomics og bioinformatik-kernefaciliteten i Nantes i vores laboratorium, der er anerkendt som franske nationale infrastrukturer i genomik (IBiSA) og bioinformatik (Institut Français de Bioinformatique) koblet til vores erfaring med NGS-datahåndtering vil sikre gennemførligheden af ​​denne opgave. Desuden er et stort genomsekventeringsprojekt, der samler mere end 1000 hele genomer (inklusive hjertepatienter og individer fra den generelle befolkning) i gang i vores gruppe. Erfaring fra dette projekt vil forstærke effektiviteten af ​​opgave #3-analysen og chancen for succes.

Opgave 4: udføre transkriptomisk og elektrofysiologisk profilering af inducerede pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter fra CIQTP-patienter for at identificere formodede biomarkører og patofysiologiske mekanismer

Efterforskerne fremsætter den hypotese, at inducerede pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM'er) genereret fra CIQPT-patienter vil give os mulighed for at identificere de globale genekspressionsændringer og elektrofysiologiske ændringer forbundet med sygdommen. Til dette formål sigter efterforskerne på at sammenligne iPSC-CM'er genereret fra medlemmer af de 4 familier beskrevet i opgave 3. Inden for hver stamtavle vil efterforskerne udvælge én "kontrol" sund forsøgsperson (der ikke præsenterer den familiære QT-forlængelse) og 2 CIPQT-patienter.

Positiv LQT-kontrol og negativ sund kontrol iPS-cellelinjer er allerede blevet genereret og undersøgt i Nantes i forbindelse med en tidligere undersøgelse af LQT2, der demonstrerer gennemførligheden af ​​denne opgave. Dette vil også give mulighed for at sammenligne CIPQT transkriptomiske og elektrofysiologiske signaturer med LTQ2. For hver linje er 3 iPS cellekloner blevet valideret: alle linjer har normal karyotype og opfylder de nuværende standarder for pluripotens. Forskerne differentierede med succes iPS-cellerne til hjerteafstamningen ved hjælp af en nyligt beskrevet metode baseret på tidsmæssig modulering af Wnt/ß-catenin-signalering ved hjælp af små molekyler. Foreløbige data tyder på, at efterforskerne kan generere høj renhed og effektivitet af hjertedifferentiering. Med hensyn til iPS-cellerne fra LQT2-patienten viste efterforskerne, at hERG A561P-mutation fører til en trafficking-defekt, der resulterer i reduceret IKr-strøm og følgelig e til forlængelse af aktionspotentiale og cellulære arytmier (tidlige efterdepolariseringer).

Efter opnåelse og validering af alle iPS-cellelinjer vil det første trin af projektet bestå i identifikation af hjertegenekspressionsprofilen forbundet med CIQTP. Til det vil efterforskerne bruge kardiomyocytter differentieret fra kontrol- og patientafledte iPS-celler (dag 28) til at udføre RNA-seq-analyser i samarbejde med Genomics-kernefaciliteten i vores laboratorium. Efterforskerne vil også udføre high-throughput aktionspotentiale og ionstrømsanalyser ved hjælp af automatiseret patch clamp og optisk baserede (CellOptiq®) teknikker under baseline forhold og efter lægemiddelinduceret adrenerg stimulering. Alt sammen vil disse analyser give os den første identifikation af den elektrofysiologiske profil forbundet med CIQTP i humane kardiomyocytter. Med denne analyse vil efterforskerne være i stand til at forbinde CIQTP-associeret ændret genekspressionsprogram til defekt hjertefysiologi.

iPSC-hjertedifferentieringsprotokoller: celler vil blive dyrket på en Matrigel-belagt plade og udsat for kardiogene cytokiner: CHIR og IWR-1. Slånde kolonier vises efter omkring 10 dage. Efter 20 dage vil cellerne blive dissocieret og gensået til elektrofysiologiske analyser 10 dage senere. Endelig, efter 28 dages differentiering, vil bankende celler blive indsamlet til RNA-seq-analyse.

Hele transkriptomsekventering (RNAseq): slå iPSC-CM'er efter 28 dage med 3 differentiering fra 2 kloner af hver iPS-cellelinje vil blive indsamlet, og RNA vil blive ekstraheret ved hjælp af Macherey-Nagel kit. Tilstedeværelse og mængde af hvert RNA i prøverne vil derefter blive vurderet ved hjælp af næste generations sekventering (Illumina HiSeq-teknologi). Bioinformatikanalyse vil blive udført af BIRD-kernefaciliteten i vores laboratorium.

Ionstrømregistreringer med automatiseret patch clamp: CIQTP's repolariseringsdefekter afspejler sandsynligvis dysfunktion af specifikke ionstrømme, der vil blive optaget ved hjælp af helcelle patch-clamp: natriumstrøm, INa, calciumstrøm, ICa,L og kaliumstrømme, IK'er og IKr.

Aktionspotentiale optagelse: Denne optagelse vil blive udført ved hjælp af 2 teknikker.

1. Isolerede bankende celler vil blive analyseret ved hjælp af perforeret patch-clamp-teknik med amphotericin B ved 37oC. Patchpipetter vil blive fyldt med en opløsning, der har en ionisk sammensætning svarende til den intracellulære væske.
2. Aktionspotentiale optiske optagelser vil blive udført på kardiomyocytter efter 28 dages differentiering, med 5 µmol/L di-8-ANEPPS som det spændingsfølsomme farvestof ved hjælp af CellOptiq®-teknologien (Clyde Biosciences). Celler vil blive inkuberet ved 37°C, 5% CO2 og 20% ​​O2 under 2 timers inkubation af farvestoffet og under optagelsen.