CIQTP-pidennys: rooli ja mekanismi äkillisessä sydänkuolemassa (IQARE-SCD)

Äkillinen sydänkuolema (SCD) on yleisin kuolinsyy kehittyneissä maissa. Arviolta 40 000 - 50 000 ihmistä kuolee äkillisesti joka vuosi Ranskassa. Suurin osa näistä kuolemista koskee iäkkäitä ihmisiä ja liittyy sepelvaltimotautiin. Kuitenkin arviolta 4000–5000 1–45-vuotiasta ihmistä kuolee äkillisesti joka vuosi Ranskassa. SCD esiintyy usein nuorilla uhreilla ilman tunnistettavia EKG-poikkeavuuksia ja ilman rakenteellisia vikoja. Tämän seurauksena useimmat nuoren aikuisen SCD-tapahtumat jäävät selittämättömiksi ja luokitellaan vaikeasti pidettyyn ryhmään, joka tunnetaan nimellä idiopaattinen kammiovärinä (IVF).

Tutkija tunnisti äskettäin uuden arytmisen kokonaisuuden (katekoliamiinin aiheuttama QT-ajan pidentyminen; CIQTP), joka on vastuussa SCD:stä ja jolle on ominaista normaali QT-kesto levossa, mutta merkittävä QT-ajan piteneminen henkisen stressitestin aikana. Tämän translaatioprojektin tavoitteena on määrittää tämän uuden harvinaisen sairauden fenotyypin esiintyvyys selittämättömässä SCD:ssä ja tunnistaa sen taustalla oleva patofysiologinen mekanismi.

Henkisen stressitestin käyttöä voitaisiin laajentaa muihin perinnöllisiin rytmihäiriöihin, kuten pitkän QT-oireyhtymään. Kun otetaan huomioon uusien sairastuneiden sukulaisten tunnistaminen, se voi vähentää merkittävästi äkillisen sydänkuoleman uusiutumisen riskiä perheessä.

Tämän projektin päätehtävä on kuvata tämän uuden SCD:hen johtavan oireyhtymän kliinisiä vaikutuksia ja patofysiologista mekanismia.

Tämän katekoliamiinin aiheuttaman QT-ajan pitenemisen äskettäisen kuvauksen perusteella tutkijat olettavat, että:

• Tämä oireyhtymä liittyy osittain 60 %:iin diagnosoimattomista suvun IVF:stä täydellisen perheseulonnan jälkeen7. Itse asiassa, koska lähtötilanteen EKG on normaali ilman MST:tä, tällaiset kliiniset piirteet voidaan tunnistaa henkisellä stressitestillä koehenkilöllä ja sukulaisilla, joilla ei ole aiemmin pidetty perinnöllistä rytmihäiriötä.
• Henkinen stressitesti auttaa tunnistamaan muiden perinnöllisten rytmihäiriöiden, kuten pitkän QT-oireyhtymän, rajatapaukset. Tälle perinnölliselle rytmihäiriölle on todellakin ominaista lähtötilanteen EKG:ssä havaittu geneettinen QT-ajan pidentyminen, mutta yli kolmanneksella potilaista on vain vähäinen QT-ajan pidentyminen lähtötilanteessa. Tästä syystä ne edellyttävät provokaatiotestien käyttöä (esim. rasitustesti ja adrenaliinitesti) paljastamaan patologinen QT-ajan piteneminen18. Tutkija olettaa, että MST voi auttaa paljastamaan tämän QT-ajan pitenemisen.
• Tämän taudin äskettäin kuvatun autosomaalisen periytymistilan tutkijan perusteella tutkija olettaa, että tämä oireyhtymä kuuluu Mendelin sairauksiin. Siksi tutkijat ehdottavat perhepohjaisen lähestymistavan soveltamista tärkeimpien CIQTP-oireyhtymään liittyvien geenien tunnistamiseen.

Tämän projektin tarkoituksena on kuvata tämän uuden äkilliseen sydänkuolemaan johtavan oireyhtymän kliinisiä vaikutuksia ja patofysiologista mekanismia. Tarkemmin sanottuna tutkijat pyrkivät:

• määrittää CIQTP:n esiintyvyys selittämättömässä SCD:ssä ja tunnistaa uusia suuria sairastuneita perheitä
• tunnistaa henkisen stressin roolin QT-ajan pidentymisessä
• tunnistaa sairauteen liittyvät geenit yhdistämällä koko genomin sekvensoinnin ja Identity By Descent -analyysin suurissa perheissä
• suorittaa CIQTP-potilaiden indusoitujen pluripotenttien kantasoluista peräisin olevien kardiomyosyyttien (iPSC-CM) transkriptomista ja elektrofysiologista profilointia putatiivisten biomarkkerien ja patofysiologisten mekanismien tunnistamiseksi.

Tämän translaatiolähestymistavan perusteella tutkijat pyrkivät kuvaamaan CIQTP:n patofysiologiaa ja kliinisiä vaikutuksia äkilliseen sydänkuolemaan. Tämän uuden oireyhtymän kuvaus käyttämällä innovatiivista lähestymistapaa, kuten koko genomin sekvensointia ja iPSC-CM-profiilia, voi tarjota kattavan ja merkittävän edistyksen selittämättömän SCD: n alalla. Äskettäin sairastuneiden sukulaisten tunnistamisen ja hoidon lisäksi se voi auttaa määrittelemään geneettiseen/patofysiologiaan perustuvan hoidon.

Tutkijat ovat jo osoittaneet, että MST on erittäin tehokas diagnostinen työkalu tämän uuden oireyhtymän havaitsemiseksi, ja tutkijat uskovat, että se voi myös auttaa paljastamaan QT-ajan pitenemisen hiljaisissa LQTS-mutaatioiden kantajissa. MST:n etuna on nopea ja helppo soveltaa. Näin ollen voisi olla erittäin mielenkiintoista paljastaa suvun segregaatio selittämättömien sydämen sähkövikojen vuoksi, jotka osoittavat autosomaalista dominanttia. Se voisi lisäksi vähentää LQTS:ssä havaittua näennäistä tunkeutumattomuutta.

Projektin tehtävät

Tehtävä 1: määritä CIQTP:n esiintyvyys selittämättömässä SCD:ssä ja tunnista uudet sairastuneita perheitä

Suurin osa SCD-tapauksista ennen 45 vuoden ikää jää selittämättömiksi ja johtuu todennäköisesti perinnöllisestä rytmihäiriöstä6. Selittämättömän SCD:n jälkeen kaikki Nantesin, Rennesin, Toursin tai Brestin yliopistollisiin sairaaloihin viitatut perheet otetaan mukaan tutkimukseen.

Kaikki saatavilla olevat kliiniset tiedot kerätään lähetettäviltä lääkäreiltä ja sukulaisilta. Kun ruumiinavaus suoritetaan, koettimet, joiden diagnoosi on saavutettavissa, suljetaan pois tutkimuksesta.

Perheen seulonta Selittämättömän SCD:n jälkeen ennen 45 vuoden ikää, perheseulonta suoritetaan ensimmäisen asteen sukulaisille ja laajennetaan sitten muille sukulaisille, jos se on positiivinen. Kun ensimmäisen asteen sukulaiset eivät ole tavoitettavissa seulontaan, se tehdään kaukaisemmille sukulaisille.

Kliininen seulonta sisältää aiemman sairaushistorian tarkastelun, kliinisen tutkimuksen ja lähtötilanteen EKG:n. Jos diagnoosia ei ole saatu tämän ensimmäisen tutkimussarjan, stressitestin, rintakehän kaikukuvauksen (TTE), natriumkanavasalpaajan altistuksen (SCBC) jälkeen joko ajmaliinilla (1 mg/kg) tai flekainidilla (2 mg/kg) ja epinefriinitestillä23, 24 esitetään. Henkinen rasitustesti suoritetaan lisäksi QT-ajan pidentymisen paljastamiseksi normaalilla EKG:lla 25.

Henkinen rasitustestiprotokolla (liite 2) MST suoritetaan seuraavasti. Potilaat asetetaan selälleen ilman selitystä testin kulusta. EKG tallennetaan lähtötilanteessa ja pysyvästi testin aikana. MST suoritetaan sitten äkillisesti potilaan koulutustason mukaan (mielinen aritmetiikka, maantiede tai Disney-hahmojen nimet lapsille) ja vaaditaan oikeita ja nopeita vastauksia. MST:tä pidetään merkityksellisenä, jos syke nousee vähintään 20 lyöntiä minuutissa. Jos syke ei nouse 20 lyöntiä minuutissa, testiä ei pidetä tulkittavana, ellei QTc-ajan merkittävää pidentymistä havaita. MST kestää yleensä alle 2 minuuttia. Uusi EKG tallennetaan 30 minuuttia testin päättymisen jälkeen, jotta saadaan EKG-jälki, jossa on alhaisin syke.

Diagnoosi

Lähtötilanteessa, rasitustestin ja farmakologisen testin aikana tehdyn EKG:n tarkastelee kaksi kliinisen ja geneettisen tilan suhteen sokeutunutta lääkäriä. Kaikki tiedot kerätään ydintietokantaan.

Diagnoosikriteerit noudattivat viimeisimmän konsensuskonferenssin ohjeita24,26. Lisäksi tutkijat pitävät delta QTm > 30 ms epinefriinin tai henkisen rasitustestin aikana ja delta QTc > 30 ms 3 min rasitustestin jälkeen riittävänä LQTS 27,28:n diagnoosiin.

Jokaisen testin välillä on pidettävä vähintään 30 minuutin tauko katekoliamiinin puhdistuman mahdollistamiseksi. Kaikki testit suoritetaan vähintään 5 päivän kuluttua kunkin hoidon keskeyttämisestä, joka saattaa häiritä testejä.

Tämä tutkimus suoritetaan eurooppalaisten kliinisen ja geneettisen tutkimuksen ohjeiden mukaisesti. Pöytäkirjan hyväksyntä hankitaan toimielinten eettisiltä komiteoilta. Jokaiselta potilaalta, joka suostui osallistumaan kliiniseen ja geneettiseen tutkimukseen, hankitaan tietoinen kirjallinen suostumus.

Tilastollinen analyysi Tilastoanalyysit suoritetaan Social Science® -ohjelmistolla (IBM Corp., Armonk, New York). Kategoriset muuttujat esitetään numeroineen ja prosentteineen. Khin-neliö- tai Fisher-tarkka testiä (perustuu odotettuun esiintymistiheyteen) käytetään kategoristen muuttujien vertaamiseen ryhmien välillä.

Kvantitatiiviset muuttujat esitetään keskiarvona ± keskihajonta tai mediaani (25.; 75.). Jatkuvien muuttujien analyysi suoritetaan käyttämällä jakaumaan perustuvaa t-testiä tai Mann Whitney -testiä. Perheiden väliset vertailut suoritetaan käyttämällä perheen sisäistä keskiarvoa tai jatkuvan muuttujan mediaania, jotta voidaan rajoittaa harhaa perheen kokoa kohtaan. Kaksipuolisen P-arvon, joka on alle 0,05, katsotaan osoittavan tilastollista merkitsevyyttä kaikissa testeissä.

Tehtävä 2: tunnistaa henkisen stressin rooli QT-ajan pidentymisessä

Määrittääkseen henkisen stressin roolin QT-ajan pidentymisessä tutkijat rekisteröivät lisäksi positiivisia ja negatiivisia kontrolliryhmiä Nantesin, Rennesin, Toursin tai Brestin yliopistollisiin sairaaloihin.

Tämä tarkoittaa sellaisten perheiden peräkkäisten sukulaisten rekisteröimistä, joilla on pitkä QT-oireyhtymä ilman QT-ajan pidentymistä lähtötilanteessa. Tämän testin tulosta verrataan tavanomaiseen seulontaan, jossa käytetään rasitustestiä ja epinefriinitestiä. Näin ollen tutkijat pyrkivät ottamaan mukaan potilaat, jotka on edelleen määritelty pitkän QT-oireyhtymän tärkeimpien geneettisesti perustuvien muotojen (LQT1, LQT2 ja LQT3, positiivinen kontrolliryhmä) kantajiksi.

Tutkijat ottavat lisäksi mukaan negatiivisen kontrolliryhmän terveistä potilaista, joilla on normaali EKG:n lähtötilanne, ei sydämen rakenteellisia poikkeavuuksia ja ilman lääkitystä, joka voisi häiritä MST:tä. Tämä populaatio koostuu sellaisten perheiden sukulaisista, jotka ovat negatiivisia selittämättömän SCD-seulonnan suhteen.

Diagnoosikriteerit ja testiprotokolla ovat samat kuin tehtävässä 1 määritellyt.

Kussakin mittauksessa käytetään kolmea peräkkäistä lyöntiä ja kahden tutkijan saama keskiarvo otetaan huomioon. QT-aika mitataan DII:ssa tai V5:ssä QRS-kompleksin alusta T-aallon loppuun (määritetään T-aallon tangentin ja isoelektrisen suoran leikkauspisteeksi). U-aalto jätetään pois QT-ajan mittauksesta.

Tämä tutkimus suoritetaan eurooppalaisten kliinisen ja geneettisen tutkimuksen ohjeiden mukaisesti. Pöytäkirjan hyväksyntä hankitaan toimielinten eettisiltä komiteoilta. Jokaiselta potilaalta, joka suostui osallistumaan kliiniseen ja geneettiseen tutkimukseen, hankitaan tietoinen kirjallinen suostumus.

Tilastolliset analyysit suoritetaan Social Science® -ohjelmistolla (IBM Corp., Armonk, New York). Ryhmien vertailut suoritetaan kunkin kliinisen ja EKG-parametrin osalta lähtötilanteessa ja molempien testien aikana (henkinen rasitustesti, rasitustesti, epinefriinitesti). Kategoriset muuttujat esitetään numeroineen ja prosentteineen. Khin-neliö- tai Fisher-tarkka testiä (perustuu odotettuun esiintymistiheyteen) käytetään kategoristen muuttujien vertaamiseen ryhmien välillä. Kvantitatiiviset muuttujat esitetään keskiarvona ± keskihajonta tai mediaani (25.; 75.). Jatkuvien muuttujien analyysi suoritetaan käyttämällä jakaumaan perustuvaa t-testiä tai Mann Whitney -testiä. Kaksipuolisen P-arvon, joka on alle 0,05, katsotaan osoittavan tilastollista merkitsevyyttä kaikissa testeissä.

Tutkija on jo kirjannut Nantesin sairaalaan 30 terveen kontrollin ja 25 koehenkilön populaation, joilla on LQTS (LQT1 = 9 tai LQT2 = 16), mutta joiden lepo-QTc < 480 ms. Ensimmäiset tulokset ovat osoittaneet, että rasitustestin, epinefriinitestin ja MST:n herkkyys on 60 %, 95 % ja 94 % perheissä ja 76 %, 93 % ja 92 % positiivisissa kontrolleissa. jokainen testi. Tämä vahvistaa, että MST-testi voi olla kiinnostava pitkä QT-potilailla, joilla ei ole selvää QT-ajan pidentymistä.

Tehtävä 3: tunnista sairauteen liittyvät erityiset geenit

Tavoite: Tunnistaa harvinaisia ​​variantteja uusista geeneistä, jotka lisäävät voimakkaasti VF:n riskiä sukutauluissa.

Nantesissa on karakterisoitu neljä suurta IVF-perhettä, joilla on 6 SCD:tä (joista 2 elvytettiin) ja 7 selittämätöntä pyörtymiskohtausta nuorella iällä. Heistä vastaavasti 9, 10, 11 ja 4 perheenjäsenellä on pidentynyt QT-aika MST:n ja/tai muun provokatiivisen testin jälkeen, kun taas kaikki LQTS:hen liittyvät geenit olivat negatiivisia. Tämän uuden kliinisen kokonaisuuden kuvaus on äskettäin hyväksytty julkaistavaksi Journal of the American College of Cardiology -lehdessä17. VF/SCD- tai EKG-poikkeavuuksien esiintyminen geneettisesti kaukana olevilla yksilöillä perheissä tekee sukutauluista erittäin voimakkaita geneettisiä tutkimuksia varten, koska mitä suurempi geneettinen etäisyys on, sitä vähemmän potilaat jakavat muunnelmia. Huomionarvoista on, että muita sukulaisia ​​tutkitaan kliinisesti (yksilöt, joiden sukutauluissa on kysymysmerkkisymbolit) ja ne voivat lisätä geneettisen tutkimuksen tehoa. J. Barcin ja Nantes-ryhmän aiemmat työt osoittivat kykymme johtaa tällaisia ​​kunnianhimoisia projekteja ja erityisesti geenien löytämistä, joka perustuu perhelähestymistapaan yhdistettynä seuraavan sukupolven sekvensointiin.

tehtävä 3.1: Koko genomin genotyypitys ja sairastuneiden perheenjäsenten analyysi Tavoite: Tunnista sairastuneiden jäsenten yhteinen genomialue.

Genominlaajuinen genotyypitys kaikille sairastuneille perheenjäsenille suoritetaan käyttämällä Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) -levyä Affymetrix GeneTitan® Multi-Channelilla, instrumentilla, joka on saatavana laboratoriomme Nantesin genomisen ydinlaitoksen kautta. Sairastuneiden perheenjäsenten yhteiset genomiset alueet arvioidaan Identity By Descent (IBD) -analyysillä, kuten aiemmin on kuvattu. Tämä vaihe on ratkaiseva sen genomialueen tarkentamiseksi, jossa syy-variantti sijaitsee. Perheiden suuren koon mukaan tutkijat voivat odottaa, että tästä analyysistä muodostuu suhteellisen pieni genomialue. Huomiota kiinnitetään mahdolliseen yhteiseen alueeseen perheiden kesken, mikä viittaa mahdolliseen yhteiseen geeniin.

tehtävä 3.2: Koko genomin sekvensointi ja analyysi Tavoite: tunnistaa harvinaiset variantit sairastuneiden perheenjäsenten jakamien genomialueiden joukosta.

Tässä tutkijat suorittavat genomin sekvensoinnin kolmella etäisesti sukulaisella yksilöllä, joilla on CIQTP-oireyhtymä jokaisesta neljästä sukutaulusta. Genomisekvensoinnin edut perustuvat sieppaus- ja PCR-vaiheiden puuttumiseen, mikä rajoittaa voimakkaasti sieppausartefakteja, peittämättömiä alueita ja tarjoaa mahdollisuuden paljastaa mutaatio ei-koodaavaan alueeseen kuuluvassa olennaisessa säätelyelementissä. Sekvensointi suoritetaan yhteistyössä National Genotyping Centerin (CEA-CNG) kanssa. NGS-putki noudattaa Broad Institute GATK "Best Practices" -suosituksia broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php. Pohjimmiltaan lukemat kartoitetaan bwa-memillä, kaksoiskappaleet poistetaan picardilla, GATK:ta käytetään lukujen uudelleenkohdistamiseen ja kalibroimiseen. Muunnoksia kutsutaan HaplotypeCallerilla ja ne kalibroidaan uudelleen GATK:lla. Luodut VCF:t merkitään sitten Ensembl Variant Effect ennustajalla. VCF-tiedostoista ja kussakin sukutaulussa tutkijat priorisoivat variantit, jotka jakavat kolme sairastavaa yksilöä ja jotka sisältyvät yhteisiin genomialueisiin (IBD). Jaetuista varianteista tutkijat keskittyvät harvinaisiin variantteihin ja suodattavat sitten pois muunnelmat, jotka ovat yleisiä yleisessä populaatiossa (pieni alleelitaajuus > 0,1 %). Tätä varten tutkijat käyttävät julkisia ja talon sisäisiä eksomi-/genomitietokantoja, jotka keräävät yhteensä noin 130 000 eksomia ja 20 000 genomia, kuten The gnomAD-konsortio, 1000Genomes, Genome of Alankomaat ja demografisesti sovitetut kontrollit erityisesti Nantesin alueelta (PREGO-tutkimus). -www.vacarme-project.org). Tämän odotetaan johtavan suppeaan luetteloon muutamista "ehdokasvarianteista/geeneistä" perhettä kohti. Ohjelmat SIFT ja Polyphen2 arvioivat bioinformatiikan ennusteen niiden toiminnallisesta vaikutuksesta ja tuovat esiin oletetut pahanlaatuiset variantit. Tutkijat validoivat kaikki Sanger-sekvensoinnilla tällä tavalla tunnistetut variantit ja tutkivat niiden yhteissegregaation muiden sairastuneiden perheenjäsenten kanssa vastaavissa sukutauluissa. Kokemus laboratoriomme Nantesin genomiikan ja bioinformatiikan ydinlaitoksesta, joka on tunnustettu Ranskan kansallisiksi infrastruktuureiksi genomiikan (IBiSA) ja bioinformatiikan (Institut Français de Bioinformatique) alalla, yhdistettynä kokemukseemme NGS-tiedonhallinnasta varmistaa tämän tehtävän toteutettavuuden. Lisäksi ryhmässämme on meneillään suuri genomin sekvensointiprojekti, joka kerää yli 1000 koko genomia (mukaan lukien sydänpotilaat ja yksilöt yleisestä väestöstä). Kokemus tästä projektista vahvistaa tehtävän nro 3 analyysin tehokkuutta ja onnistumisen mahdollisuuksia.

Tehtävä 4: Suorita CIQTP-potilaiden indusoitujen pluripotenttien kantasoluperäisten kardiomyosyyttien transkriptominen ja elektrofysiologinen profilointi putatiivisten biomarkkerien ja patofysiologisten mekanismien tunnistamiseksi

Tutkijat esittävät hypoteesin, että CIQPT-potilaista syntyneet indusoidut pluripotentit kantasoluista peräisin olevat sydänlihassolut (iPSC-CM) antavat meille mahdollisuuden tunnistaa sairauteen liittyvät globaalit geeniekspression muutokset ja sähköfysiologiset muutokset. Tätä varten tutkijat pyrkivät vertaamaan tehtävässä 3 kuvatun neljän perheen jäsenistä luotuja iPSC-CM:itä. Jokaisesta sukutaulusta tutkijat valitsevat yhden "kontrollin" terveen koehenkilön (jolla ei ole suvun QT-ajan pidentymistä) ja 2 CIPQT-potilasta.

Positiivinen LQT-kontrolli ja negatiivinen terve kontrolli iPS-solulinjoja on jo luotu ja tutkittu Nantesissa aiemman LQT2-tutkimuksen yhteydessä, joka osoittaa tämän tehtävän toteutettavuuden. Tämä tarjoaa myös mahdollisuuden verrata CIPQT:n transkriptomista ja elektrofysiologista allekirjoitusta LTQ2:een. Jokaiselle linjalle on validoitu 3 iPS-solukloonia: kaikilla linjoilla on normaali karyotyyppi ja ne täyttävät nykyiset pluripotenssistandardit. Tutkijat erilaistivat onnistuneesti iPS-solut sydämen linjaksi käyttämällä äskettäin kuvattua menetelmää, joka perustuu Wnt/ß-kateniinin signaalin ajalliseen modulaatioon pieniä molekyylejä käyttäen. Alustavat tiedot viittaavat siihen, että tutkijat voivat tuottaa sydämen erilaistumisen korkean puhtauden ja tehokkuuden. Mitä tulee LQT2-potilaan iPS-soluihin, tutkijat osoittivat, että hERG A561P -mutaatio johtaa liikennöintivirheeseen, joka johtaa alentuneeseen IKr-virtaan ja sen seurauksena toimintapotentiaalin pidentymiseen ja solujen rytmihäiriöihin (varhaiset jälkidepolarisaatiot).

Kun kaikki iPS-solulinjat on hankittu ja validoitu, projektin ensimmäinen vaihe on CIQTP:hen liittyvän sydämen geeniekspressioprofiilin tunnistaminen. Tätä varten tutkijat käyttävät kardiomyosyyttejä, jotka on erotettu kontrolli- ja potilasperäisistä iPS-soluista (päivä 28) RNA-sekvenssianalyysien suorittamiseen yhteistyössä laboratoriomme Genomics-ydinlaitoksen kanssa. Tutkijat suorittavat myös korkean suorituskyvyn toimintapotentiaali- ja ionivirta-analyysejä käyttämällä automaattisia patch clamp- ja optisia (CellOptiq®) -tekniikoita perusolosuhteissa ja lääkkeiden aiheuttaman adrenergisen stimulaation jälkeen. Yhdessä nämä analyysit antavat meille ensimmäisen tunnistamisen CIQTP:hen liittyvästä elektrofysiologisesta profiilista ihmisen sydänlihassoluissa. Tämän analyysin avulla tutkijat pystyvät yhdistämään CIQTP:hen liittyvän muuttuneen geenin ilmentämisohjelman vialliseen sydämen fysiologiaan.

iPSC:n sydämen erilaistumisprotokollat: soluja viljellään Matrigel-päällystetyllä levyllä ja altistetaan kardiogeenisille sytokiineille: CHIR ja IWR-1. Pahoinpitelypesäkkeet ilmestyvät noin 10 päivän kuluttua. 20 päivän kuluttua solut dissosioidaan ja kylvetään uudelleen elektrofysiologisia analyyseja varten 10 päivää myöhemmin. Lopuksi 28 päivän erilaistumisen jälkeen lyövät solut kerätään RNA-sekvenssianalyysiä varten.

Koko transkriptoimisekvensointi (RNAseq): iPSC-CM:ien lyöminen 28 päivän kohdalla 3 erilaistumisen jälkeen kunkin iPS-solulinjan 2 kloonista kerätään ja RNA uutetaan käyttäen Macherey-Nagel-pakkausta. Näytteiden kunkin RNA:n läsnäolo ja määrä arvioidaan sitten seuraavan sukupolven sekvensointia (Illumina HiSeq -tekniikkaa) käyttäen. Bioinformatiikan analyysi suorittaa laboratoriomme BIRD-ydinlaitos.

Ionivirran tallentaminen automatisoidulla patch clampilla: CIQTP:n repolarisaatiovirheet heijastavat todennäköisesti tiettyjen ionivirtojen toimintahäiriöitä, jotka tallennetaan käyttämällä kokosolun patch-clampia: natriumvirta, INa, kalsiumvirta, ICa, L ja kaliumvirrat, IKs ja IKr.

Toimintapotentiaalin tallennus: Tämä tallennus suoritetaan käyttämällä kahta tekniikkaa.

1. Eristetyt lyöntisolut analysoidaan käyttämällä rei'itettyä patch-clamp -tekniikkaa amfoterisiini B:llä 37 oC:ssa. Laastaripipetit täytetään liuoksella, jonka ioninen koostumus on samanlainen kuin solunsisäisellä nesteellä.
2. Toimintapotentiaalin optiset tallennukset tehdään kardiomyosyyteille 28 päivän erilaistumisen jälkeen käyttämällä 5 µmol/l di-8-ANEPPS:ää jänniteherkänä väriaineena käyttäen CellOptiq®-teknologiaa (Clyde Biosciences). Soluja inkuboidaan 37 °C:ssa, 5 % C02:ssa ja 20 % 02:ssa väriaineen 2 tunnin inkubaation ja tallennuksen aikana.