CIQTP 延長 : 心臓突然死における役割とメカニズム (IQARE-SCD)

心臓突然死 (SCD) は、先進国における主要な死因です。 フランスでは、毎年 40,000 ～ 50,000 人が突然死亡していると推定されています。 これらの死亡のほとんどは高齢者が関与しており、冠動脈疾患に関連しています。 しかし、フランスでは毎年、1 歳から 45 歳までの推定 4000 人から 5000 人が突然死亡しています。 SCD は、識別可能な ECG 異常や構造的欠陥のない若い犠牲者に発生することがよくあります。 その結果、若年成人のほとんどの SCD イベントは原因不明のままであり、特発性心室細動 (IVF) として知られるとらえどころのないグループに分類されます。

研究者は最近、SCD の原因であり、安静時の正常な QT 持続時間と、精神的ストレス テスト中の主要な QT 延長を特徴とする新しい不整脈エンティティ (カテコールアミン誘発 QT 延長; CIQTP) を特定しました。 このトランスレーショナル プロジェクトの目的は、原因不明の SCD における希少疾患のこの新しい表現型の有病率を判断し、その根底にある病態生理学的メカニズムを特定することです。

メンタル ストレス テストの使用は、QT 延長症候群などの他の遺伝性不整脈疾患にも拡張できます。 新たに罹患した近親者が特定される可能性があることを考えると、家族内での心臓突然死の再発リスクの大幅な低下につながる可能性があります。

このプロジェクトの主な課題は、SCD につながるこの新しい症候群の臨床的意義と病態生理学的メカニズムを説明することです。

このカテコールアミン誘発 QT 延長に関する最近の記述に基づいて、研究者は次のように仮説を立てています。

• この症候群は、完全な家族スクリーニング後に未診断の家族性 IVF の 60% に部分的に関与しています 7。 実際、ベースライン ECG は MST なしで正常であるため、そのような臨床的特徴の特定は、遺伝性不整脈疾患の影響を受けていないと以前に考えられていた発端者および親戚の精神的ストレステストによって実行される場合があります。
• メンタル ストレス テストは、QT 延長症候群などの他の遺伝性不整脈の境界例を特定するのに役立ちます。 実際、この遺伝性不整脈は、ベースライン ECG で観察された遺伝子に基づく QT 間隔の延長によって特徴付けられますが、患者の 3 分の 1 以上がベースラインでわずかな QT 延長のみを示します。 その結果、挑発テストを使用する必要があります (例: 運動テストとアドレナリン テスト) 病的な QT 延長を明らかにする 18。 治験責任医師は、MST がこの QT 延長の正体を明らかにするのに役立つかもしれないという仮説を立てています。
• この疾患について最近報告された常染色体遺伝様式の研究者に基づいて、研究者は、この症候群がメンデル性疾患に属するという仮説を立てています。 したがって、研究者は、家族ベースのアプローチを適用して、CIQTP 症候群に関連する主要な遺伝子を特定することを提案しています。

このプロジェクトの範囲は、心臓突然死につながるこの新しい症候群の臨床的意義と病態生理学的メカニズムを説明することです。 より具体的には、調査員は次のことを目指しています。

• 原因不明の SCD における CIQTP の有病率を判断し、新たな大規模な罹患家族を特定する
• QT延長における精神的ストレスの役割を特定する
• 大家族における全ゲノムシーケンシングとIdentity By Descent解析を組み合わせて、疾患に関連する遺伝子を特定する
• CIQTP 患者からの人工多能性幹細胞由来心筋細胞 (iPSC-CM) のトランスクリプトームおよび電気生理学的プロファイリングを実行して、推定バイオマーカーと病態生理学的メカニズムを特定します。

このトランスレーショナル アプローチに基づいて、研究者は、心臓突然死における CIQTP の病態生理学と臨床的意味を説明することを目指しています。 全ゲノム配列決定や iPSC-CM プロファイリングなどの革新的なアプローチを使用したこの新しい症候群の説明は、原因不明の SCD の分野で包括的かつ大きな進歩をもたらす可能性があります。 新たに罹患した近親者の特定とケアを超えて、遺伝的/病態生理学に基づく治療法を定義するのに役立つ可能性があります。

研究者は、MSTがこの新しい症候群を検出するための非常に効率的な診断ツールであることをすでに証明しており、研究者は、MSTがサイレントLQTS突然変異キャリアのQT延長を明らかにするのにも役立つ可能性があると考えています. MST には、迅速かつ簡単に適用できるという利点があります。 したがって、常染色体優性伝達を示す原因不明の心臓の電気的欠陥の家族性分離を明らかにすることは、非常に興味深い可能性があります。 さらに、LQTS で発生する明らかな非浸透性を低下させる可能性があります。

プロジェクトのタスク

タスク 1: 原因不明の SCD における CIQTP の有病率を判断し、新しい影響を受ける家族を特定する

45 歳未満の SCD のほとんどの症例は原因不明のままであり、遺伝性不整脈疾患が原因である可能性が高い 6。 原因不明のSCDの後、ナント、レンヌ、トゥール、またはブレスト大学病院に紹介されたすべての連続した家族が研究に含まれます。

利用可能なすべての臨床発端者データは、参照元の医師および親戚から収集されます。 剖検が行われると、診断が達成可能な発端者は研究から除外されます。

家族スクリーニング 45 歳未満の原因不明の SCD の後、家族スクリーニングは第一度近親者で実施され、陽性の場合は他の近親者に拡大されます。 第一度近親者がスクリーニングに参加できない場合は、より遠い親族で実施されます。

臨床スクリーニングには、過去の病歴、臨床検査、ベースラインECGのレビューが含まれます。 この最初の一連の試験、ストレス テスト、経胸壁心エコー図 (TTE)、アジマリン (1 mg/kg) またはフレカイニド (2 mg/kg) のいずれかによるナトリウム チャネル遮断薬投与 (SCBC) およびエピネフリン テストの後に診断がない場合23、 24が行われます。 メンタルストレステストは、通常のベースラインECG 25でQT延長を明らかにするためにさらに実行されます。

メンタル ストレス テスト プロトコル (付録 2) MST は次のように実行されます。 患者は仰臥位に置かれ、検査過程についての説明はありません。 ECG はベースラインで記録され、テスト中は永久に記録されます。 次に MST は、患者の教育レベル (暗算、地理、または子供向けのディズニー キャラクターの名前) に応じて、正確かつ迅速な回答を求めて突然実行されます。 MST は、心拍数が毎分 20 回以上増加した場合に関連があると見なされます。 心拍数が毎分 20 回増加しない場合、QTc の大幅な延長が確認されない限り、テストは解釈不能と見なされます。 MST は通常 2 分未満続きます。 心拍数が最も低い ECG トレースを取得するために、テスト終了の 30 分後に新しい ECG が記録されます。

診断

ベースライン時、ストレステスト中、および薬理学的テスト中に実施されたECGは、臨床的および遺伝的状態を知らされていない2人の医師によってレビューされます。 すべてのデータはコア データベースに収集されます。

診断基準は、最新のコンセンサス会議のガイドラインに準拠しています。 研究者はさらに、エピネフリンまたは精神的ストレス テスト中にデルタ QTm > 30 ミリ秒、およびストレス テストの 3 分後にデルタ QTc > 30 ミリ秒を考慮し、LQTS 27,28 の診断に十分です。

カテコールアミンのクリアランスを可能にするために、各テスト間の最小間隔は 30 分です。 すべてのテストは、テストを妨げる可能性のある各治療を中断してから少なくとも 5 日後に実行されます。

この研究は、臨床および遺伝子研究に関するヨーロッパのガイドラインに従って実施されています。 プロトコルの承認は、機関の倫理委員会から取得されます。 臨床および遺伝子研究への参加に同意した各患者から、書面によるインフォームド コンセントが得られます。

統計分析 統計分析は、Ｓｏｃｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）ソフトウェア（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｍｏｎｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いて行われる。 カテゴリ変数は、その数とパーセンテージで表示されます。 カイ 2 乗またはフィッシャーの正確確率検定 (予想頻度に基づく) を使用して、グループ間のカテゴリ変数を比較します。

量的変数は、平均 ± 標準偏差または中央値 (25 日; 75 日) として表示されます。 連続変数の分析は、分布に基づく t 検定またはマン ホイットニー検定を使用して実行されます。 家系内の平均値または連続変数の中央値を使用して家系間の比較を行い、家系のサイズに対するバイアスを制限します。 0.05 未満の両側 P 値は、すべてのテストで統計的有意性を示すと見なされます。

タスク 2: QT 延長における精神的ストレスの役割を特定する

QT延長における精神的ストレスの役割を特定するために、研究者はナント、レンヌ、トゥール、またはブレスト大学病院に陽性対照群と陰性対照群をさらに登録します。

これは、ベースラインでQT延長のないQT延長症候群の影響を受けた家族の連続した親戚の登録に含まれます。 このテストの結果は、運動テストとエピネフリンテストを使用した従来のスクリーニングと比較されます。 これにより、研究者は、QT延長症候群の主な遺伝的形態の保因者としてさらに定義された患者を登録することを目指しています（LQT1、LQT2およびLQT3、陽性対照群）。

治験責任医師はさらに、ベースライン心電図が正常で、心臓の構造的異常がなく、MST を妨げる可能性のある投薬を受けていない健康な患者の陰性対照群を登録します。 この集団は、原因不明のSCDスクリーニングが陰性の家族の親族で構成されます。

診断基準とテスト プロトコルは、タスク 1 で定義されたものと同じになります。

各測定には 3 回の連続拍動が使用され、2 人の研究者によって得られた平均値が考慮されます。 QT 間隔は、QRS コンプレックスの始まりから T 波の終わりまで (T 波のタンジェントと等電位線の交点として定義される)、DII または V5 で測定されます。 U 波は QT 間隔の測定から除外されます。

この研究は、臨床および遺伝子研究に関するヨーロッパのガイドラインに従って実施されています。 プロトコルの承認は、機関の倫理委員会から取得されます。 臨床および遺伝子研究への参加に同意した各患者から、書面によるインフォームド コンセントが得られます。

統計分析は、Ｓｏｃｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）ソフトウェア（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｍｏｎｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いて行われる。 グループ間の比較は、ベースライン時および両方のテスト（精神的ストレステスト、運動テスト、エピネフリンテスト）中に、各臨床およびECGパラメーターについて実行されます。 カテゴリ変数は、その数とパーセンテージで表示されます。 カイ 2 乗またはフィッシャーの正確確率検定 (予想頻度に基づく) を使用して、グループ間のカテゴリ変数を比較します。 量的変数は、平均 ± 標準偏差または中央値 (25 日; 75 日) として表示されます。 連続変数の分析は、分布に基づく t 検定またはマン ホイットニー検定を使用して実行されます。 0.05 未満の両側 P 値は、すべてのテストで統計的有意性を示すと見なされます。

治験責任医師は、30 人の健常対照者と、LQTS (LQT1=9 または LQT2=16) に罹患しているが安静時の QTc が 480 ms 未満の 25 人の被験者の集団をナント病院に登録済みです。 最初の結果では、運動テスト、エピネフリン テスト、および MST の感度が、家族内でそれぞれ 60%、95%、および 94%、陽性対照内で 76%、93%、および 92% であることが確認されました。すべてのテスト。 これは、明確な QT 延長がない QT 延長患者に MST 検査が有用である可能性があることを裏付けています。

タスク 3: 疾患に関連する特定の遺伝子を特定する

目的: 血統内の VF のリスクに強く寄与する新しい遺伝子のまれなバリアントを特定すること。

ナントでは、6 人の SCD (2 人は蘇生) と 7 人の原因不明の失神のエピソードを示す 4 つの大規模な IVF 家族が特徴付けられています。 それらの中で、それぞれ 9、10、11、および 4 人のファミリー メンバーが、MST および/または別の挑発的なテスト後に延長された QT 間隔を示しますが、すべての LQTS 関連遺伝子は陰性でした。 この新しい臨床実体の説明は、最近、Journal of the American College of Cardiology17 に掲載されました。 家系内の遺伝的に離れた個体における VF/SCD または ECG 異常の発生は、遺伝的距離が大きいほど、患者が共有するバリアントが少なくなるため、家系が遺伝子研究にとって非常に強力になります。 注目すべきは、追加の近親者が臨床的に調査され（以下の家系図に疑問符記号が付いている個人）、遺伝学研究の力を高める可能性がある. J. Barc と Nantes グループの以前の研究では、このような野心的なプロジェクト、特に次世代シーケンシングと組み合わせた家族的アプローチに基づく遺伝子発見をリードする当社の能力が実証されました。

タスク3.1: 影響を受けた家族の全ゲノムジェノタイピングと分析 目的: 影響を受けたメンバーが共有するゲノム領域を特定します。

影響を受けるすべての家族のゲノムワイドなジェノタイピングは、Affymetrix GeneTitan® Multi-Channel の Axiom Genome-Wide Human Precision Medicine Research Array (PMRA) Plate を使用して実行されます。 影響を受けた家族が共有するゲノム領域は、前述のようにIdentity By Descent（IBD）分析によって評価されます。 このステップは、原因となるバリアントが配置されているゲノム領域を絞り込むために重要です。 家族の規模が大きいことから、研究者は、この分析から比較的小さなゲノム領域が現れると予想できます。 潜在的な共通遺伝子を示す可能性のある家族間の潜在的な共有領域に注意が向けられます。

タスク3.2: 全ゲノム配列決定と分析 目的: 罹患した家族が共有するゲノム領域の中でまれなバリアントを特定します。

ここで、研究者は、4 家系のそれぞれから CIQTP 症候群の影響を受けた遠縁の 3 人の個人のゲノム配列決定を行うものとします。 ゲノム配列決定の利点は、キャプチャと PCR のステップがないことにあり、キャプチャ アーティファクト、カバーされていない領域を強く制限し、非コード領域に属する必須の調節要素内の変異を明らかにする可能性を提供します。 シーケンスは、National Genotyping Center (CEA-CNG) と共同で実施されます。 NGS パイプラインは、Broad Institute GATK の「ベスト プラクティス」broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices.php の推奨事項に従っています。 基本的に、読み取りは bwa-mem を使用してマップされ、重複は picard を使用して削除され、GATK は読み取りの再調整と再調整に使用されます。 バリアントは HaplotypeCaller で呼び出され、GATK で再調整されます。 生成された VCF には、Ensembl Variant Effect 予測子で注釈が付けられます。 VCF ファイルから、各血統内で、研究者は 3 人の罹患者によって共有され、共有ゲノム領域 (IBD) 内に含まれるバリアントを優先するものとします。 共有バリアントから、研究者はまれなバリアントに注目し、一般集団で一般的なバリアントを除外します (マイナー アレル頻度 > 0.1%)。 このために、研究者は、gnomAD コンソーシアム、1000Genomes、オランダのゲノム、特にナント地域の人口統計学的に一致した対照など、合計で約 130,000 のエクソームと 20,000 のゲノムを収集する公開および社内のエクソーム/ゲノム データベースを使用します (PREGO 研究-www.vacarme-project.org)。 これにより、ファミリーごとにいくつかの「候補」バリアント/遺伝子のショートリストが作成されると予想されます。 それらの機能的効果のバイオインフォマティクス予測は、プログラム SIFT および Polyphen2 によって評価され、それらの中から推定される悪性変異体が強調されます。 調査員は、サンガーシーケンスによってそのように特定されたすべてのバリアントを検証し、それぞれの家系で影響を受けた他の家族メンバーとの共分離を調査します。 ゲノミクス (IBiSA) およびバイオインフォマティクス (Institut Français de Bioinformatique) におけるフランスの国家インフラストラクチャとして認識されている、私たちの研究室のナントのゲノミクスおよびバイオインフォマティクスのコア施設の経験と、NGS データ管理の経験が相まって、このタスクの実現可能性が保証されます。 さらに、1000 以上の全ゲノム (心臓病患者および一般集団の個人を含む) を収集する大規模なゲノム配列決定プロジェクトが、私たちのグループで進行中です。 このプロジェクトでの経験は、タスク 3 の分析の効率と成功の可能性を強化します。

タスク 4: CIQTP 患者からの人工多能性幹細胞由来の心筋細胞のトランスクリプトームおよび電気生理学的プロファイリングを実行して、推定バイオマーカーと病態生理学的メカニズムを特定します。

研究者らは、CIQPT 患者から生成された人工多能性幹細胞由来心筋細胞 (iPSC-CM) により、疾患に関連する全体的な遺伝子発現の変化と電気生理学的変化を特定できるという仮説を立てています。 そのため、研究者は、タスク 3 で説明されている 4 つの家族のメンバーから生成された iPSC-CM を比較することを目指しています。各血統内で、研究者は 1 つの「対照」健常者 (家族性 QT 延長を示さない) と 2 人の CIPQT 患者を選択します。

陽性の LQT コントロールおよび陰性の健康なコントロール iPS 細胞株は、このタスクの実現可能性を示す LQT2 に関する以前の研究に関連して、すでにナントで生成および研究されています。 これは、CIPQT トランスクリプトームおよび電気生理学的シグネチャを LTQ2 のものと比較する機会も提供します。 各系統について、3 つの iPS 細胞クローンが検証されています。すべての系統は正常な核型を持ち、現在の多能性の基準を満たしています。 研究者らは、小分子を使用した Wnt/β-カテニン シグナル伝達の時間的変調に基づく最近報告された方法を使用して、iPS 細胞を心臓系統に分化させることに成功しました。 予備データは、研究者が心臓分化の高純度と効率を生み出すことができることを示唆しています。 LQT2 患者の iPS 細胞に関して、研究者らは、hERG A561P 変異が IKr 電流の減少をもたらす人身売買の欠陥につながり、その結果、活動電位の延長と細胞性不整脈 (早期後脱分極) を引き起こすことを示しました。

すべての iPS 細胞株を取得して検証すると、プロジェクトの最初のステップは、CIQTP に関連する心臓遺伝子発現プロファイルの特定になります。 そのために、研究者は、コントロールと患者由来の iPS 細胞 (28 日目) から分化した心筋細胞を使用して、私たちのラボのゲノミクスコア施設と協力して、RNA seq 分析を実行します。 研究者はまた、ベースライン条件下および薬物誘発性アドレナリン刺激後に、自動パッチクランプおよび光学ベース（CellOptiq®）技術を使用して、ハイスループット活動電位およびイオン電流分析を実行します。 すべてを組み合わせると、これらの分析により、ヒト心筋細胞のCIQTPに関連する電気生理学的プロファイルの最初の同定が得られます。 この分析により、研究者はCIQTP関連の変更された遺伝子発現プログラムを欠陥のある心臓生理学に関連付けることができます。

iPSC 心臓分化プロトコル: 細胞は、マトリゲル コーティング プレート上で培養され、心原性サイトカインにさらされます: CHIR および IWR-1。 約10日後にビートコロニーが現れます。 20日後、細胞は解離され、10日後に電気生理学的分析のために再播種されます。 最後に、分化の 28 日後、破裂細胞は RNA 配列分析のために収集されます。

全トランスクリプトーム シーケンス (RNAseq): 各 iPS 細胞株の 2 つのクローンから 3 つの分化の 28 日目に iPSC-CM を破り、Macherey-Nagel キットを使用して RNA を抽出します。 サンプルの各 RNA の存在と量は、次世代シーケンシング (イルミナ HiSeq テクノロジー) を使用して評価されます。 バイオインフォマティクス分析は、当研究室の BIRD コア施設によって実行されます。

自動パッチクランプによるイオン電流記録: CIQTP の再分極欠陥は、全細胞パッチクランプを使用して記録される特定のイオン電流の機能不全を反映している可能性があります: ナトリウム電流、INa、カルシウム電流、ICa、L、およびカリウム電流、IKs および IKr。

活動電位の記録: この記録は、2 つの手法を使用して実行されます。

1. 単離された鼓動細胞は、37℃でアムホテリシン B を用いた穿孔パッチクランプ技術を使用して分析されます。 パッチ ピペットは、細胞内液に似たイオン組成を持つ溶液で満たされます。
2. CellOptiq® テクノロジー (Clyde Biosciences) を使用して、5 µmol/L ジ-8-ANEPPS を電圧感受性色素として、28 日間の分化後に心筋細胞で活動電位光学記録を実行します。 細胞は、色素の2時間のインキュベーション中および記録中に、37°C​​、5% CO2および20% O2でインキュベートされます。